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研究人员通过CRISPR-Cas9诱导的DNA瘢痕形成追踪生物发育

2019-04-23 09:18:51 • 来源：

诸如RNA测序的技术现在揭示了哪些基因在每个单独的细胞中表达。然后可以使用相似的表达谱系统地排列所有细胞。亥姆霍兹联合会(MDC)MaxDelbrück分子医学中心定量发育生物学研究组负责人Jan Philipp Junker博士说：“每当我们使用这种技术检查器官或生物体时，我们都找不到只有熟悉的细胞类型，还有未知和罕见的细胞类型。下一个问题很明显 - 这些不同的类型来自何处?“Junker的团队现在已经在Nature Biotechnology上发表了一篇论文这描述了一种名为LINNAEUS的技术，使研究人员能够确定细胞类型以及每个细胞的谱系。

研究人员通过CRISPR-Cas9诱导的DNA瘢痕形成追踪生物发育

“我们希望了解有机体发展的灵活性，”容克说。如果在胚胎发育过程中发生损伤，例如，由于突变或环境影响，修复机制确保动物后来看起来健康。只有每个细胞的谱系才能分辨出损伤程度和修复机制的真实故事。甚至成年斑马鱼的心脏也可以在受伤后再生。“这是一个重复的生物发展过程，还是一个新的事物?”容克说。“细胞会改变并承担其他任务吗?”在某些情况下，缺失的细胞类型是导致特定疾病的原因。将来，研究人员将能够使用谱系树利用LINNAEUS可追溯的所有细胞，以形成关于这些问题的新假设。

快速修补会导致意外疤痕

该技术基于DNA中的疤痕，它们像条形码一样起作用，从中可以确定每个细胞的谱系。虽然斑马鱼胚胎仍然处于单细胞阶段，但Junker的团队注入了CRISPR-Cas9系统。在接下来的8个小时内，Cas9反复切割出鱼类肯定不需要的序列：红色荧光蛋白(RFP)的基因。胚胎的红色光芒逐渐消失，DNA伤口上形成数千个疤痕。“CRISPR总是在确切的位置进行切割。但在下一次细胞分裂发生前，细胞修复时间不超过15分钟，”容克说。“必须快速完成修补，因此染色体片段会粘在一起。这就是错误发生的地方.DNA中的疤痕是随机长度的，它们的确切位置也会发生变化。”子细胞在细胞分裂过程中遗传了遗传性瘢痕。因此，可以通过其遗传瘢痕鉴定源自共同祖先的细胞。

虽然单细胞RNA测序按细胞类型映射数千个细胞，但瘢痕显示细胞之间有数百万个连接。从这种混乱的数据中重建谱系树带来了各种挑战。有些伤疤特别容易发生。“这很危险，因为如果在心脏和脑细胞中产生相同的疤痕序列，人们可能会错误地认为它们有共同的祖先，”容克说。因此，我们必须知道哪些序列我们不能信任并过滤掉它们。“此外，并非所有细胞中的伤疤都能被发现，生物信息学家Bastiaan Spanjaard说，”该研究的主要作者之一。“因此我们开发了一种方法弥合数据中的空白，使我们能够构建谱系树。“

放大数据集

最终结果是谱系树，其中树枝分裂的彩色饼图。每个分区都是一个疤痕，饼图上的每种颜色都显示它出现在哪种细胞类型中。研究人员可以根据需要尽可能详细地放大极大型数据集的紧凑表示。

“例如，在心脏中，有两种细胞类型几乎无法区分。但谱系树显示它们的发育很早就在不同方向分支，”容克说。“我们接下来想要了解这些细胞类型在鱼心中的位置。这通常首先表明它们所服务的功能。”他的实验室继续使用斑马鱼作为模型生物，但Junker也看到了将这种技术应用于人类器官的巨大潜力。这最终可以帮助我们了解患者中的哪些突变会对细胞谱系树造成永久性损伤。

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