请概述基于W离子的异亮氨酸亮氨酸测定(WILD™)技术及其如何帮助确保抗体蛋白质测序的100%准确性。

抗体蛋白质测序的目的是准确推断出一级序列中存在的每个单个氨基酸。从原始代码中错误测序的表达的抗体蛋白质与原始抗体相比可能引起显着不同的结合行为。甚至一级序列中的单个氨基酸错误也可能对最终抗体结构具有破坏性影响。

在20种氨基酸中，异亮氨酸(Ile)和亮氨酸(Leu)具有相同的分子量，并且使用常规质谱(MS)实验不能彼此区分。因此，通过常规MS方法的蛋白质测序缺乏可靠的准确性

为了解决这个问题，我们开发了WILD™。WILD™代表W-离子异亮氨酸亮氨酸测定技术，并利用Ile和Leu之间的结构差异。WILD™充分利用先进的碎裂技术，如电子传输高能碰撞解离(EThcD)，内置于MS仪器中，打破侧链(图1中的橙色剪刀)，以产生卫星w离子。在碎裂过程中产生的w-离子将具有不同的质量转移，其可以准确且可靠地识别特定残留物。

为什么能够区分亮氨酸和异亮氨酸，特别是在CDRs中，这一点很重要?

抗体的互补决定区(CDR)对每种抗原具有高度特异性的序列。因此，CDR中存在的残基的顺序和类型对于抗体的功能是至关重要的。

尽管Iob和Leu具有同量异位，但它们具有不同的结构，这决定了不同的抗体 - 抗原相互作用。我们已经观察到Ile和Leu结构差异可以影响抗体的结合亲和力，并且在一些情况下，当CDR区域中或其周围不正确的Ile或Leu残基时，不再发生结合。

亮氨酸和异亮氨酸在抗体蛋白中，特别是在CDR中有多普遍?

这是一个有趣的问题，因为CDR中的Ile和Leu数量可能非常随机。图2是我们在2018年美国质谱学会年会上发表的海报的修改版本。

该海报描绘了我们测序的数百种单克隆抗体产生的数据。如您所见，一些抗体在六个CDR中的任何一个中都没有异亮氨酸或亮氨酸。然而，另一方面，我们观察到一些病例在CDR中总共有9个Ile或Leu。然而，平均而言，CDR将包含至少三至五个Ile或Leu残基。

如果不确定亮氨酸和异亮氨酸之间的差异，研究人员将如何确定抗体在实践中起作用?

如果没有准确测定两种同量异位氨基酸，研究人员只能使用排列来预测序列中所有可能的Ile或Leu位置。然而，在许多情况下，这可能既不可行也不经济。

例如，对于抗体具有9个Ile或Leu的项目，研究人员甚至可能无法生成表达所有500种或更多种可能的组合以识别正确的，更不用说功能性的抗体。

直到最近，这种测序的黄金标准是什么?与WILD™相比，请概述这些技术及其优缺点。

Edman降解是最常用的蛋白质测序技术。该技术依赖于循环过程，该过程涉及化学催化以协调从肽的N-末端开始重复去除氨基酸，然后通过电泳，色谱和质谱法检测氨基酸。

Edman退化具有相当大的缺点。首先，该方法需要大量的原料。其次，因为该过程依赖于在去除之前标记N-末端，所以它不能处理具有难以接近的N-末端的肽。第三，Edman测序吞吐量非常低。Edman退化的一个周期可能需要长达一个小时。

最后，在实践中，Edman降解只能测序约30个氨基酸。在鉴定所有Ile和Leu残基之前，需要通过电泳或色谱法从肽混合物中分离含有Ile和Leu的肽，因为常规MS实验不能区分Ile和Leu。这项任务既麻烦又低效。对所有含有Ile和Leu的肽进行测序需要数天。尽管Edman测序对于阐明抗体序列非常重要，但这项技术存在许多缺陷，并且现在基本上已经过时。

最近，通过酶催化然后进行MS分析，已经实现了蛋白质向肽的片段化。最初鉴定目标抗体蛋白上的切割位点以预测潜在片段，然后使用MS实验与观察到的片段进行比较。

通常，酶胰凝乳蛋白酶用于产生消化模式，其可以帮助区分Ile和Leu残基。我们过去也使用酶消化抗体。我们注意到，在不同条件下从不同供应商处购买的酶对不同抗体的表现不同。我们还发现酶错误率非常高，并且该方法通常不可重复且不可靠。因此，我们寻求开发高精度，可重复性和可靠性的方法：WILD™。

WILD™技术有哪些限制?

我们的WILD™技术在技术开发和市场意识方面仍然相当新颖。但是，我们继续提高其吞吐量和准确性。目前，WILDTM可以在一轮中确定90%准确度的样本序列;我们采用其他轮次来确保可重复性并达到100%的准确度。

对复杂混合物的额外回合的这种需求转化为延迟，但是随着持续改进，我们希望大大减少生产时间。我们继续为复杂抗体进行精心设计的实验，以便将来我们可以100%准确地确定样品中的所有Ile和Leu残留物。我们特别投入并渴望着手确定多克隆和寡克隆混合物中的抗体序列。

WILD™技术和Rapid Novor的未来是什么?

我们希望WILDTM技术可用于指导未来的重组工作，以指导疫苗合理设计和免疫治疗策略。