加利福尼亚大学伯克利分校和马萨诸塞州综合医院的科学家已经确定了Cas9蛋白中的一个关键区域，该区域控制着CRISPR-Cas9在靶DNA序列中的准确程度，并对其进行了调整，以生成一个超精确的基因编辑器。迄今为止最低水平的脱靶切割。

研究人员说，研究人员认为，作为DNA切割主控制器的蛋白质结构域是重新设计的明显目标，可进一步提高准确性。这种方法应该有助于科学家定制Cas9的变体 - 结合并切割DNA的蛋白质 - 以最小化CRISPR-Cas9在错误的位置编辑DNA的机会，这是在人类进行基因治疗时的一个关键考虑因素。

实现提高准确度的一个策略是在控制蛋白质结构域中创建称为REC3的突变，并查看哪些突变提高了准确性而不影响目标切割的效率。

“我们发现即使是Cas9的REC3结构域的微小改变也会影响目标编辑和非目标编辑之间的差异，这表明该结构域是深入诱变以提高靶向特异性的明显候选者。作为此的延伸可以在REC3中进行比我们所做的靶向突变更无偏见的诱变，“共同第一作者Janice Chen说，他是Jennifer Doudna实验室的研究生，共同发明了CRISPR-Cas9基因编辑工具。

共同第一作者Chen，Yavuz Dagdas和Benjamin Kleinstiver以及他们在加州大学伯克利分校，马萨诸塞州综合医院和哈佛大学的同事今天在线发表在Nature杂志上的报道。

超精确的Cas9

自2012年以来，分子和细胞生物学教授Doudna和加州大学伯克利分校的霍华德休斯医学研究所研究员，以及马克斯普朗克感染生物学研究所的同事Emmanuelle Charpentier重新利用Cas9蛋白质创造了一种便宜，精确且易于使用的方法。 - 使用基因编辑器，研究人员试图减少脱靶编辑的机会。虽然提高保真度有利于基础研究，但在编辑临床应用基因时绝对至关重要，因为任何脱靶DNA切割都可能使关键基因失效并导致永久性的意外副作用。

在过去两年中，两个团队设计了高度准确的Cas9蛋白 - 一种称为eSpCas9(1.1)的增强特异性和一种称为SpCas9-HF1的高保真 - 而Chen和Doudna试图了解为什么它们切割的特异性高于野生来自化脓性链球菌的Cas9蛋白在今天被广泛使用。

目前，使用CRISPR-Cas9的研究人员创建了单指导RNA(sgRNA) - 一种RNA分子，其中包含20个核糖核酸链，这些核酸与其想要靶向的特定20核酸DNA序列互补，并将其连接到Cas9。该指导RNA允许Cas9置于互补DNA上，与其结合并切割双链螺旋。但Cas9-sgRNA复合物也可以与不完全匹配的DNA结合，导致不希望的脱靶切割。

2015年，Doudna的实验室发现了Cas9的构象转换，当RNA引导和DNA靶标匹配时，它会被激活。他们发现，只有当RNA和DNA紧密匹配Cas9的3D结构，特别是HNH核酸酶结构域的构象时，才能改变并激活Cas9的剪刀。然而，负责检测构象转换上游核酸的过程仍然未知。

在目前的研究中，Chen和Dagdas使用一种称为单分子FRET(Förster共振能量转移)的技术来精确测量Cas9-sgRNA蛋白复合物中的各种蛋白质结构域 - 特别是REC3，REC2和HNH - 如何在复合物中移动与DNA结合。

他们首先确定eSpCas9(1.1)和SpCas9-HF1赋予的特异性益处可以解释为这些Cas9变体的HNH构象转换阈值远高于野生型Cas9蛋白，这使得eSpCas9成为可能。 (1.1)和SpCas9-HF1变体在结合脱靶序列时不太可能激活剪刀。

接下来，他们发现REC3结构域负责检测靶结合的准确性，然后发出REC2结构域的向外旋转信号，打开HNH核酸酶结构域的路径，激活剪刀。然后Cas9的这种活性构象能够切割靶DNA的两条链。

Chen，Dagdas和Kleinstiver随后表明，通过突变部分REC3，可以改变Cas9蛋白的特异性，使HNH核酸酶不被激活，除非引导RNA和靶DNA匹配非常接近。他们能够设计出一种改进的超精确Cas9，被称为HypaCas9，它保留了其目标效率，但在区分人类细胞中的目标和非目标位点方面略胜一筹。

“如果你突变REC3中的某些氨基酸残基，你可以调整Cas9靶向活性和改善特异性之间的平衡;我们能够找到在目标靶标上有足够活性的甜点，但也可以大幅减少 - 目标事件，“陈说。

通过继续探索Cas9的结构，功能和动力学之间的关系，Doudna和她的团队希望进一步设计具有精确灵敏度的蛋白质，以可靠和有效地进行各种遗传改变。