基因工程机制可视化

金泽大学和东京大学的研究人员在Nature Communications上报告了“分子剪刀”动力学的可视化 - 这是CRISPR-Cas9基因工程技术的主要机制。

基因工程中使用的技术之一 - 人工修饰活生物体基因组的过程 - 涉及所谓的CRISPR-Cas9核酸酶系统。使用该系统，可以在期望的位点切割细胞的DNA，其中可以删除或添加基因。通过与Cas9蛋白结合的'指导RNA'分子来选择待切割的位点。现在，由金泽大学的Mikihiro Shibata和东京大学的Osamu Nureki领导的研究小组已经可视化了CRISPR-Cas9复合物的动态，特别是它如何切割DNA，为CRISPR-Cas9介导的DNA提供了宝贵的见解。解理机制。

对于他们的可视化研究，科学家们使用高速原子力显微镜(HS-AFM)，一种成像表面的方法。通过在其上移动微小的悬臂来探测表面;探头经受的力可以转换为高度测量值。然后扫描整个表面得到样品的高度图。Shibata及其同事的高速实验设置实现了极快的重复扫描 - 可转换成参与分子剪切作用的生物分子的电影。

首先，科学家们比较了没有和附着RNA的Cas9(Cas9-RNA)。他们发现前者能够灵活地采用各种构象，而后者具有固定的双叶结构，突出了指导RNA的构象稳定能力。然后，Shibata及其同事研究了稳定的Cas9-RNA复合物如何靶向DNA。他们证实它与DNA中预先选择的原始间隔区相邻基序(PAM)位点结合。PAM是位于DNA靶位点旁边的短核苷酸序列，其与指导RNA互补。

该研究小组的高速电影进一步揭示了靶向('DNA询问')是通过Cas9-RNA复合物的三维扩散实现的。最后，研究人员设法将切割过程本身的动态可视化：他们观察了Cas9-RNA局部解开双链DNA后，“分子剪刀”区域如何经历构象波动。

Shibata的工作促进了我们对CRISPR-Cas9基因组编辑机制的理解。用研究人员的话来说：“...这项研究提供了关于CRISPR-Cas9功能动力学的前所未有的细节，并强调了HS-AFM可能阐明来自不同CRISPR-Cas系统的RNA引导效应核酸酶的作用机制。”

CRISPR-Cas9

CRISPR是“聚集的规则间隔的短回文重复序列”的缩写，指的是一组细菌DNA序列，其含有早先攻击细菌的病毒DNA片段。细菌使用这些片段来防止相同病毒的进一步攻击。“Cas”指CRISPR相关基因;“Cas9”是具有两个核酸酶结构域的CRISPR相关蛋白(核酸酶是能够切割核酸，DNA和RNA中存在的有机分子的酶)。

近年来，开发了一种基因工程技术，其中CRISPR-Cas9复合物充当“分子剪刀”;Cas9核酸酶与指导RNA分子结合，指导RNA分子包含有关靶位点的DNA位点信息。使用高速原子力显微镜，金泽大学的Mikihiro Shibata及其同事现在已经非常详细地研究了CRISPR-Cas9复合物的动力学。

原子力显微镜

原子力显微镜(AFM)是一种成像技术，其中通过用非常小的尖端扫描表面来形成图像。尖端的水平扫描运动通过压电元件控制，而垂直运动转换成高度轮廓，导致样品表面的高度分布。由于该技术不涉及透镜，因此其分辨率不受所谓的衍射极限的限制。在高速设置中，AFM可用于实时生成样本演变的电影。高速AFM已被成功用于研究蛋白质动力学，例如肌动蛋白V在肌动蛋白丝上行走，光诱导的细菌视紫红质构象变化和纤维素降解。

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