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发现小分子抑制剂可以精确控制CRISPR-Cas9基因组编辑

研究人员5月2日在Cell杂志上报道,首次发现化脓性链球菌Cas9(SpCas9)蛋白的小分子抑制剂可以更精确地控制基于CRISPR-Cas9的基因组编辑。

发现小分子抑制剂可以精确控制CRISPR-Cas9基因组编辑

通过开发一系列高通量生物化学和基于细胞的分析,研究人员筛选了多种小分子,以鉴定破坏SpCas9与DNA结合从而干扰其切割DNA能力的化合物。这些第一种小分子CRISPR-Cas9抑制剂很容易进入细胞,并且比先前发现的抗CRISPR蛋白小得多。这些新化合物可以对基于SpCas9的技术进行可逆和剂量依赖性控制,包括其在哺乳动物细胞中进行基因编辑,碱基编辑和表观遗传编辑的应用。

这些研究为快速鉴定和使用针对SpCas9和下一代CRISPR相关核酸酶的小分子抑制剂奠定了基础。靶向CRISPR相关核酸酶的小分子抑制剂具有在基础,生物医学和国防研究以及生物技术应用中广泛使用的潜力。“

哈佛医学院博士学院和布莱根妇女医院的高级作者Amit Choudhary

目前,SpCas9正在开发作为多种疾病的基因治疗剂,包括HIV,视力障碍,肌肉萎缩症和其他遗传性疾病。但是,这些治疗应用将极大地受益于对SpCas9活性的剂量和时间的精确控制以减少脱靶效应。控制SpCas9活动的这些方面也可以使其他应用受益,例如有效编辑模型生物的DNA以模拟和研究疾病,以及基因驱动在基因工程蚊子工程蚊子中的使用,以遏制疟疾和其他蚊子传播疾病。

对SpCas9的剂量和时间控制的需求已经产生了对抗CRISPR分子的需求。尽管存在靶向SpCas9的抗CRISPR蛋白,但它们很大并且对细胞不可渗透,在行动中不可逆转,可被蛋白酶咀嚼,并且可能在体内造成不良免疫反应的风险。相反,小分子抑制剂是蛋白水解稳定的,可逆的,并且通常是非免疫原性的,并且可以通过被动扩散容易地递送至细胞。此外,它们可以低成本大规模合成,几批间差异很小。

使用这些分析,研究人员首先筛选了多类小分子的代表成员,以确定其成员经常抑制SpCas9的类别。该团队确定了两种先导化合物,这些化合物破坏了SpCas9在人类细胞系中以剂量依赖性方式结合DNA和抑制SpCas9介导的DNA切割的能力。由于它们通过酶阻断DNA结合,因此这些分子还抑制SpCas9的催化受损技术,包括用于转录激活的技术,并且在人血浆中是稳定的。在这项新研究中,Choudhary及其团队推出了一个强大,灵敏且可扩展的平台,用于快速,经济地鉴定和验证SpCas9的小分子抑制剂。由于SpCas9酶的特性,以高通量方式测量CRISPR-Cas9活性以允许药物筛选一直是具有挑战性的。在新论文中,Choudhary及其同事分别开发了针对SpCas9-DNA结合和SpCas9 DNA切割活性的高通量初级和二级检测。对于初步测定,他们使用称为荧光偏振的生物化学技术来监测SpCas9与含有PAM序列的荧光团标记的DNA片段之间的相互作用。在二级分析中,

“这些结果为CRISPR-Cas9活动的精确化学控制奠定了基础,使得能够安全使用这些技术,”Choudhary说。“然而,这些分子还没有为人类应用做好准备,也没有在生物体内进行功效测试。”

在未来的研究中,研究人员计划在SpCas9:gRNA复合物上鉴定抑制剂的结合位点,检查其作用机制,并优化其效力。他们还将确定分子是否与哺乳动物细胞中的其他靶标相互作用,并评估它们对其他CRISPR相关核酸酶的特异性。细胞论文中包含的早期结果表明,这些分子对其靶标非常特异,因为它们对远缘相关的CRISPR酶Cas12a没有影响。

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