在一项对研究，医学和工业产生重大影响的成就中，加州大学旧金山分校的科学家们已经对人体免疫细胞进行了遗传重编程，称为T细胞而不使用病毒插入DNA。研究人员表示，他们希望他们的技术 - 采用CRISPR基因编辑技术的快速，通用和经济的方法 - 在新兴的细胞治疗领域被广泛采用，从而加速开发新的和更安全的癌症，自身免疫和其他治疗方法。疾病，包括罕见的遗传性疾病。

这种新方法描述于2018年7月11日出版的Nature，它提供了一种强大的分子“切割和粘贴”系统，用于重写人类T细胞中的基因组序列。它依赖于电穿孔，这是一种将电场施加到细胞上以使其膜暂时更具渗透性的过程。在一年内试验了数千个变量后，加州大学旧金山分校的研究人员发现，当某些数量的T细胞，DNA和CRISPR“剪刀”混合在一起，然后暴露在适当的电场中时，T细胞就会在这些元件中，精确地将特定的基因序列整合到基因组中编程的CRISPR编程位点。

“这是一种快速，灵活的方法，可用于改变，增强和重新编程T细胞，因此我们可以为他们提供我们想要摧毁癌症，识别感染或遏制自身免疫性疾病中过度免疫反应的特异性，”加州大学旧金山分校的Alex Marson，医学博士，博士，微生物学和免疫学副教授，加州大学旧金山分校海伦迪勒家庭综合癌症中心成员，以及新研究的高级作者。“现在我们在所有这些方面都参加了比赛。”

但同样重要的是新技术的速度和易用性，Marson，也是创新基因组学研究所的生物医学科学主任说，这种方法可以将大量的DNA插入T细胞，这可以赋予T细胞细胞具有强大的新特性。Marson实验室的成员使用电穿孔和CRISPR将一些遗传物质插入到T细胞中取得了一些成功，但直到现在，许多研究人员多次尝试将长序列DNA置于T细胞中导致细胞死亡，导致大多数细胞死亡。相信大的DNA序列对T细胞过度毒性。

为了证明新方法的多功能性和功效，研究人员用它来修复患有罕见遗传形式的自身免疫的儿童T细胞中的致病基因突变，并且还创建了定制的T细胞来寻找和杀死人类黑色素瘤细胞。

病毒通过细胞膜注射自己的遗传物质引起感染，自20世纪70年代以来，科学家利用这种能力，剥夺感染性病毒的病毒，并利用生成的“病毒载体”将DNA转运到细胞中进行研究，基因治疗，并在最近公布的例子，用于创建用于癌症免疫疗法的CAR-T细胞。

用病毒工程改造的T细胞现在被美国食品和药物管理局批准用于对抗某些类型的白血病和淋巴瘤。但是，创建病毒载体是一项艰苦而昂贵的过程，临床级载体的短缺导致基因疗法和基于细胞的疗法的制造瓶颈。即使可用，病毒载体仍远非理想，因为它们将基因随意插入细胞基因组中，这可能损害现有的健康基因或留下由监管机制无法控制的新引入的基因，从而确保细胞正常运作。这些可能导致严重副作用的限制引起基因治疗和细胞疗法如基于CAR-T的免疫疗法的关注。

“试图将新基因导入T细胞已有30年的努力，”第一作者Theo Roth说，他是一名攻读医学博士和博士学位的学生。加州大学旧金山分校医学科学家培训计划的学位，他在Marson实验室设计并领导了这项新研究。“现在不再需要六个或七个人在实验室中使用病毒来设计T细胞，如果我们开始看到数百个实验室设计这些细胞而不仅仅是少数，并且越来越多地工作复杂的DNA序列，我们将尝试更多的可能性，它将显着加快未来几代细胞疗法的发展。“

经过近一年的反复试验，Roth确定了T细胞群体，DNA数量和CRISPR丰度的比例，结合使用适当参数传递的电场，可以有效，准确地编辑T细胞。 '基因组。

为了证实这些发现，罗斯指示CRISPR用绿色荧光蛋白(GFP)标记一系列不同的T细胞蛋白，结果具有高度特异性，具有非常低水平的“脱靶”效应：每个亚细胞结构Roth的CRISPR模板设计用GFP标记，没有其他人在显微镜下发出绿光。

然后，在设计用作新技术治疗前景原理的补充实验中，Roth，Marson及其同事展示了它如何潜在地用于整合T细胞对抗自身免疫性疾病或癌症。

在第一个例子中，Roth及其同事使用由耶鲁大学医学院的医学博士Kevan Herold提供给Marson实验室的T细胞。这些细胞来自三个兄弟姐妹，患有罕见的严重自身免疫性疾病，迄今为止一直对治疗有抵抗力。基因组测序显示，这些儿童的T细胞携带一种名为IL2RA的基因突变。该基因包含对调节性T细胞或Tregs发育所必需的细胞表面受体的说明，其可以控制其他免疫细胞并防止自身免疫。

利用非病毒CRISPR技术，UCSF团队能够快速修复儿童T细胞中的IL2RA缺陷，并恢复受突变影响的细胞信号。在CAR-T治疗中，已经从体内移除的T细胞被设计为增强其抗癌能力，然后返回身体以靶向肿瘤。研究人员希望类似的方法可以有效治疗Tregs发生故障的自身免疫性疾病，例如在三名患有IL2RA突变的儿童中看到的疾病。

在与加州大学洛杉矶分校Parker癌症免疫治疗研究所的Cristina Puig-Saus和医学博士Antoni Ribas合作进行的第二组实验中，科学家完全取代了正常人群中的天然T细胞受体。具有新受体的T细胞经过专门设计以寻找人黑素瘤细胞的特定亚型。T细胞受体是细胞用于检测疾病或感染的传感器，并且在实验室培养皿中，工程细胞有效地归巢于靶向黑素瘤细胞而忽略其他细胞，表现出精确癌症医学的主要目标的那种特异性。

在不使用病毒的情况下，研究人员能够生成大量经过重新编程的CRISPR工程细胞，以展示新的T细胞受体。当转移到植入人黑素瘤肿瘤的小鼠中时，工程化的人T细胞进入肿瘤部位并显示出抗癌活性。

“这种替代T细胞受体的策略可以推广到任何T细胞受体，”Marson说，他也是加州大学旧金山分校帕克癌症免疫治疗研究所和Chan Zuckerberg Biohub研究员的成员。“通过这种新技术，我们可以剪切并粘贴到指定的位置，重写基因组序列中的特定页面。”

Roth说，因为新技术可以在一周多一点的时间内创建可行的定制T细胞系，它已经改变了Marson实验室的研究环境。由于病毒载体带来的障碍，之前被认为过于困难或昂贵的实验的想法现在已经成熟，可供调查。“我们将研究20个'疯狂'的想法，”Roth说，“因为我们可以非常快速地创建CRISPR模板，一旦我们有了模板，我们就可以将它放入T细胞并快速生长。”

Marson将新方法的成功归功于罗斯的“绝对坚持”，面对人们普遍认为病毒载体是必需的，并且T细胞只能容忍小片DNA。“Theo确信，如果我们能够找到合适的条件，我们就可以克服这些感知的局限性，并且他付出了巨大努力来测试数以千计的不同条件：CRISPR与DNA的比例;培养细胞的不同方式;不同的电流。通过优化每个参数并将最佳条件放在一起，他能够看到这个惊人的结果。“