杜克大学的生物医学工程师使用CRISPR / Cas9基因工程技术关闭一种调节成年小鼠胆固醇水平的基因，导致单次治疗后血液胆固醇水平降低和基因抑制持续6个月。

这标志着研究人员首次将CRISPR / Cas9阻遏物用于成年动物模型中的靶向治疗基因沉默。该研究于4月26日在Nature Communications网站上发布。

CRISPR / Cas9系统基于细菌中的抗病毒防御机制，其中Cas9酶识别先前感染的病毒DNA序列并在再感染期间切断入侵的DNA。研究人员已经设计了CRISPR / Cas9系统，不仅可以定位和切割特定的DNA序列，还可以打开或关闭靶基因的表达，而无需对DNA编码序列进行永久性更改。

尽管这种CRISPR / Cas9阻遏蛋白技术已经成为破坏细胞培养模型中基因调控的有力工具，但它尚未适应基因治疗等应用向成年动物的传递。

在他们最近的研究中，杜克大学生物医学工程的鲁尼家庭副教授查尔斯·格斯巴赫(Charles Gersbach)和他的实验室成员开发了一种方法，可以有效地将CRISPR / Cas9阻遏物系统包装并交付给小鼠。他们通过沉默Pcsk9来测试他们的传递系统，Pcsk9是一种调节胆固醇水平的基因。虽然已开发出几种药物通过阻断Pcsk9的活性来治疗高胆固醇和心血管疾病，但这种新方法将阻止Pcsk9的制造。

“我们之前使用这些相同类型的工具在培养的细胞中打开和关闭基因，我们希望看看我们是否也可以通过与基因治疗相关的方法将它们传递给动物模型，”Gersbach说。“我们希望以一种具有治疗效果的方式改变基因，而Pcsk9是一种有用的概念证据，因为它可以调节胆固醇水平，从而影响心脏病等健康问题。”

为了测试成年动物中的靶向Pcsk9阻遏物，研究小组选择使用腺病毒相关病毒(AAV)载体 - 在人类基因治疗临床试验中经过工程改造以靶向多种组织类型的小病毒。由于载体的载货量极小，该团队无法使用化脓性链球菌的常见Cas9酶。相反，他们选择使用来自金黄色葡萄球菌的较小的Cas9。它们还使Cas9的DNA切割功能失活，产生了“死”形式的酶dCas9，其结合但不切割靶DNA序列。

dCas9可与KRAB蛋白结合，沉默基因表达，创建CRISPR / Cas9阻遏物，阻断转录，降低染色质可及性，沉默基因表达而不改变基础DNA序列。研究人员利用腺病毒载体将基于CRISPR / Cas9的阻遏物传递给小鼠肝脏，降低了治疗小鼠的Pcsk9和胆固醇水平。

虽然实验成功，但研究人员还观察到仅在包括Cas9的治疗中将肝酶释放到血液中。虽然这些肝酶水平保持低于临界阈值并随时间标准化，但它们的升高水平表明该疗法可能在肝脏中引起免疫应答，其中病毒和Cas9酶累积。这引发了对多次注射疗效的质疑。

“我们发现的一个有趣的事情看起来就像对Cas9蛋白的免疫反应，”在Gersbach实验室领导这项工作的博士生Pratiksha Thakore说。“注射后，我们看到我们的靶基因Pcsk9的水平降低了，但我们也观察到许多免疫细胞基因表达的增加，这表明我们将Cas9传递给小鼠后免疫细胞渗入肝脏。更好地了解这种免疫反应以及如何调节它对于使用Cas9技术进行治疗非常重要。“

随着研究人员开发出使用CRISPR / Cas9进行治疗和研究的新方法，有关生物体免疫系统如何响应CRISPR / Cas9系统传递的更多信息正在出现。因为Cas9酶来自细菌，免疫系统可能将其识别为来自入侵生物体的外来蛋白质并产生反应。还有人担心基于CRISPR / Cas9的疗法的潜在患者可能已经准备好对这些系统产生免疫反应，因为研究中最常用的Cas9酶来自人类常规暴露的常见细菌。

“该领域刚刚开始关注这一点，很明显免疫反应是一个重要问题，”格斯巴赫说。“虽然我们在给予Cas9时确实看到了小鼠的免疫反应，但是血清中的肝酶水平似乎在没有任何干预的情况下随着时间的推移而减轻，并且Pcsk9抑制的效果无论如何都是持续的。”

随着他们继续研究，Gersbach及其合作者希望收集更多信息，以更好地了解针对Cas9的免疫应答和表观遗传调节的稳定性。

“我们仍然有很多东西需要我们用这种方法来探索，”塔卡尔说。“CRISPR / Cas9工具在细胞培养模型中运作良好，在体内应用它们更令人兴奋，特别是当我们检查重要的治疗靶点并使用与治疗人类疾病相关的运载工具时。”