测序单细胞基因组的力量
作为生命的基本单位,每个细胞都含有生物基因组的完整拷贝,随着细胞的生长和分裂,它可以经历动态DNA突变。研究单细胞的基因组对于跟踪数百或数千个细胞的全局变化模式非常重要,并将有助于阐明DNA随时间发生的变化。除此之外,这将使科学家能够深入了解基因组中突变和多样性的发展,以及跟踪与不同疾病的起源和进展相关的遗传变化。
在本期Genome Advance中,我们专注于一种新技术,使研究人员能够准确地对单个细胞进行测序。
传统的全基因组测序技术使用从大量细胞中提取的DNA来获得足够的起始材料用于测序。通过将DNA序列的许多短位(称为读段)比对或拼接而获得正常的共有序列。通过频率确定基因组每个位置的同一性,使得在每个位置仅出现最常见的碱基对或字母出现在最终序列中。然而,由于可以平均显着的差异,这种方法忽略了群体中细胞之间的大部分差异。
为了解决这个问题,研究人员一直致力于优化可以对单个细胞进行测序的技术。由于单个细胞只含有少量的DNA,只有几皮克(皮克数等于一万亿分之一克),因此相当大的技术挑战一直是确定DNA扩增的最佳方法 - 制作多个拷贝DNA - 达到测序所需的足够量。
现有方法使用非线性或指数扩增。换句话说,在复制过程的每个循环中,从原件复制的DNA可以作为制作更多拷贝的模板。但是,如果在早期复制周期中发生复制错误,或者如果基因组的某些部分比其他部分更有效地扩增,那么这些拷贝将在最终样本中过量表示。这些技术,包括多重置换扩增和聚合酶链反应,通常用于扩增来自单个细胞的DNA用于测序。
这些技术中固有的偏差可导致整个基因组中测序读数的不均匀分布以及最终序列覆盖的较低百分比的基因组。因此,这些方法通常不够敏感,无法检测单核苷酸多态性(SNPs) - DNA序列单个字母的变异 - 和拷贝数变异(CNV)等变异 - DNA片段数量的差异通常被删除或重复的。
由哈佛大学的Xiaoliang Sunney Xie小组教授在2012年12月21日的“科学”杂志上发表的一种新的扩增方法减少了这种偏见。这种技术称为多重退火和基于环路的扩增循环(MALBAC),采用特殊引物启动扩增过程,允许以非指数方式复制DNA。(引物是与DNA模板结合的互补DNA分子的短链,并作为合成新DNA的起点。)
使用MALBAC提高单细胞测序的准确性和质量代表了基础科学和个体化医学的重大进步。这项技术可以帮助科学家了解专业和遗传上不同的细胞如何协同作用,形成像大脑网络这样的复杂系统。当只有一个细胞可用于分析时,它对于跟踪癌症,筛查产前样本或测试法医标本也可能是有价值的。
通过在MALBAC中使用特殊引物,扩增基因组DNA以形成不能作为进一步复制的模板的环。由于这些扩增环的形成,在每个循环中只能复制初始基因组DNA,导致原始DNA的近线性扩增。该预扩增过程减少了现有方法中存在的大量测序偏差。它还促进整个基因组的更均匀复制,产生序列,其中至少一个序列读数覆盖高达93%的基因组,平均25个读数。相比之下,作者发现用多重置换扩增测序,一种常用于从单细胞扩增DNA的现有方法,在相同条件下仅产生72%的基因组覆盖率。
使用MALBAC的均一基因组扩增使作者能够准确地检测结肠癌细胞系中SNP和CNV的产生和积累,这是现有方法无法可靠地进行的。这些数据可能对于理解肿瘤进展,跟踪循环肿瘤细胞和确定临床环境中个体患者的药物治疗反应具有意义。
该技术也可用于测序其他类型的细胞。在与中国北京北京大学李瑞强教授及其同事合作发表的一篇配套论文中,作者应用MALBAC对来自健康供体的99个精子细胞的基因组进行测序。
与人体其他细胞不同,卵子和精子细胞只含有一组染色体; 精子和卵子的结合导致受精细胞具有包含人类基因组的正常23对染色体。在染色体分离(分离)并分配到不同细胞之前,通过在每对染色体之间混合DNA的交叉事件将遗传多样性引入卵子和精子细胞。在这些交叉事件期间或染色体分离期间产生的异常是出生缺陷和流产的最常见来源,并且还可能与男性不育有关。
作者发现甚至在健康供体的精子中也可以发现诸如SNP和CNV等DNA异常。通过研究单个精子细胞中的SNP,作者能够以非常高的分辨率绘制交叉事件或染色体分离错误的位置。这项研究和其他类似研究对于理解基因组不稳定性和生育能力具有重要意义。
新技术的其他令人兴奋的用途包括研究微生物种群的动态性质,例如人类微生物群 - 一群生活在人体内部和外部的细菌,真菌,原生动物和病毒,并有助于维持人类健康。(有关更多信息,请参阅:人类微生物组计划。)在其他环境中繁殖的细菌研究将有助于我们探索不同微生物的基因组变异,并可能有助于可再生生物燃料和其他环境可持续技术的开发。
这只是开始。随着技术的不断优化,科学家们将能够将单细胞测序应用于各种问题,包括各种物种的动态基因组变异,以及环境和人类健康。
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