使用微流体整体装置从血液中分离完整细菌
新兴的单细胞诊断依赖于快速有效地从复杂的生物基质中分离细菌的潜力。最近发表在Microsystems和Nanoengineering上的一项研究,Jung Y. Han及其同事在美国机械工程,化学生物分子工程和生物工程学院的跨学科系统开发了一种装置,使用微流体多孔二氧化硅整料从全血中分离出完整和存活的细菌。它们实现了机械溶血,同时通过整料提供完整和存活的细菌,用于基于大小的细菌分离和选择性裂解。韩等人。描述了合成大量离散的毛细管结合的整体元件和毫米级整体砖以整合到微流体芯片中的方法。
他们探讨了整体形态,几何形状和流动条件对细胞裂解和流动状态的影响,这些细胞裂解和流动状态允许选择性细胞裂解和多克革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的选择性传代。Han等人采用的技术。当与单细胞拉曼光谱法结合时,允许快速样品制备和细菌分析。这项工作提供了独特的样品制备步骤,以支持在应用程序的快速和免费培养细菌分析定点护理生物医学设备。
血液中的细菌可导致败血症,组织感染和其他严重的疾病,需要及早发现血源性细菌进行有效治疗。使用即时诊断快速鉴定细菌的能力可以极大地增强早期感染期间最佳治疗的临床潜力。用于细菌表征的现有金标准基于表型细胞培养分析,并且需要至少24小时来收集样品用于在诊断和临床微生物学实验室中进行培养和分析。现有技术稳健且价格低廉,但不能产生及时的结果来指导治疗的初始阶段。
在目前的工作中,Han等人。探索了与多孔硅胶整体结合的微流体装置,作为简单的流通元件,用于选择性血细胞分析和细菌的完整分离。整料是高度多孔的材料,由开孔形态组成,具有扭曲的流体流动路径。科学家可以通过细胞灌注过程中的高机械表面应力来控制整体孔隙形态,从而实现血细胞的机械溶血,同时允许完整和有活力的细菌通过蜿蜒的流动路径进行无培养分离。韩等人。尽管存在细菌菌株的差异,但在流动条件下对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌种使用全血中细菌的选择性传代方法。高通量选择性整体溶解技术与强大的分析方法(如拉曼光谱)相结合,可以在单细胞水平上对全血中的细菌进行无培养分析。
DLS测量(a)初始25倍稀释的血液,化学裂解的血液和通过整体装置灌注裂解的血液,显示机械整体溶解的细胞碎片大小显着减少而不是化学裂解。(b)悬浮在1×PBS中的阴沟肠杆菌的DLS测量,以及通过整体装置灌注的样品,显示细菌大小没有变化。(c)对掺有阴沟肠杆菌的100×稀释血液的DLS测量,以及从多孔整料的出口收集的样品。入口样品中的宽峰表示混合的血细胞和小细菌细胞群,而出口样品显示大的(>2μm)细胞显着减少,如光学图像中所证实的。比例尺=25μm。改进先前报道的二氧化硅整料合成方法,然后在低温下水解和缩合二氧化硅以形成二氧化硅玻璃。为了制备二氧化硅整料,科学家使用由烷基硅酸盐,聚乙二醇(PEG)作为致孔剂,尿素作为羟基离子源的前体溶液,以最小化异质性和乙酸。当他们优化合成过程时,得到的整料是均匀的并且良好地锚定在二氧化硅毛细管壁上。科学家测量了最终骨架整体结构的厚度,并使用高效液相色谱计算了其渗透性控制实验条件。为了尽量减少内在变异,Han等人。将得到的毛细管切成5厘米长的段,以便在使用前测试渗透性。
然后,他们开发了两种互补的低通量和高通量操作方法,将二氧化硅整料结合到微流体系统中。为了实现低通量操作,科学家在热塑性微流体芯片中嵌入含有整块的毛细管段,以在整合过程中保护整体结构。对于高通量选择性裂解,它们使用在微流体装置内具有较大横截面积的整料。完整的制造方法为全血灌注期间的无泄漏操作提供了极好的可靠性。
作为原理证明,Han等人。选择阴沟肠杆菌(革兰氏阴性,杆状细菌)来探讨其传代效果,以及三种革兰氏阳性细菌; 乳酸乳球菌,藤黄微球菌和枯草芽孢杆菌。在实验期间,他们通过具有不同几何形状和流动条件的微流体整料灌注细菌溶液,以使用动态光散射(DLS)测试细菌通过和血细胞裂解。例如,通过整料灌注纯化的阴沟肠杆菌不会在DLS峰中产生可辨别的变化,表明细菌完整传代。
科学家们展示了多孔整体装置长度对红细胞裂解(RBC)效率的影响。结果表明,对于1mm以上的整体长度,RBC裂解效率显着增加。韩等人。还研究了整体装置操作期间白细胞(WBC)的命运,细胞不能通过整块而不像RBC那样被溶解。从技术上讲,红细胞变形为盘状,通过整块,导致膜张力显着增加,导致RBC溶解。相比之下,细菌细胞具有与整体孔相似的尺寸,因此需要较少的细胞壁膨胀以成功通过而不会破裂。科学家们针对不同的细菌优化了设备的参数,以承受高水平的膜应力而不会破裂。进一步的发展确保了细菌的完整通过而没有降解和生存能力。
对于高通量细菌传代,科学家们稀释了毛细血管装置中的血液。然而,作为替代方案,它们还可以扩展单块体的全血裂解能力。该装置处理超过400μL掺入细菌的全血,然后由于细胞裂解导致的堵塞以及由于多孔基质内捕获的完整白细胞(WBC)而显示出背压的显着增加。
为了找到目标细菌,Han等人。在通过整体工艺之后,获得沉积在载玻片上的样品。他们通过手动扫描样品上的光学探针进行单细胞拉曼分析。他们期望使用选择性裂解技术,与未来的共焦拉曼显微镜相结合,以改善在确定的感兴趣位置以低浓度检测感兴趣的细菌菌株的过程。
通过这种方式,Jung Y. Han及其同事开发了一种微流体整料,可有效地分离出完整的细菌,具有广泛的治疗诊断,临床应用潜力。他们设想了共聚焦拉曼显微镜工具的结合,这些工具目前主要局限于研究实验室,新兴的小型化和手持式系统为快速便携的床边护理设备铺平了道路。
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