利用DNA，RNA和蛋白质之间的相互作用，有望检测生物标记物，诊断疾病和改善癌症靶向治疗。量化这些相互作用对于理解和控制其生物分子机制至关重要。多角度光散射(MALS)是一种强大的工具，可直接测量溶液中蛋白质，核酸和复合物的摩尔质量，无需荧光或放射性标记。

在这次访谈中，Sophia Kenrick博士与News-Medical Life Sciences讨论了两种互补的光散射技术，尺寸排阻色谱结合多角度光散射(MALS)和成分梯度MALS，为分析核酸提供了表征工具。以及核酸和蛋白质之间的相互作用。

你能解释研究蛋白质 - 核酸相互作用的重要性吗?

目前开发用于治疗多种疾病的生物治疗剂基于广泛的生物聚合物。通常，生物治疗剂是工程化抗体，但现在所有种类的生物聚合物都用于生产治疗剂。基于DNA和RNA的生物治疗剂作为癌症免疫疗法和癌症疫苗正变得越来越普遍。

这种治疗的功效取决于将RNA递送至免疫细胞并将其转化为肿瘤靶向剂。交付方面对其功效至关重要。因此，我们必须了解所使用的生物聚合物的性质以及它们如何与其他生物化合物相互作用，以使它们尽可能有效。因此，生物物理特征是必不可少的。例如，递送效率可能取决于聚合物与RNA结合的程度，或者纯化过程可能会导致单链RNA形成您不想要的双链体。

表征核酸与宿主蛋白或其他分子之间的相互作用对于理解健康和疾病状态的潜在生物学也是至关重要的。获取有关这些分子如何结合的详细信息有助于我们了解结构/功能关系，并通知敏感或高亲和力生物传感器的发展。

如何使用光散射来表征这种相互作用?

光散射研究可以提供关于这些复合物的大小，摩尔质量和构象的关键信息。可以直接测量分子的摩尔质量和与其结合配体的相互作用强度，而无需标记或摩尔质量标准。这降低了人工制品的风险。

有几种方法可以将光散射技术应用于DNA和RNA表征。MALS，动态光散射和电泳光散射都可用于表征物理性质，例如尺寸，分子量和电荷。

在案例研究中使用了哪种光散射技术?

两个案例研究都使用多角度光散射或MALS。当激光指向溶液时，大部分光线一直通过，但是一些光线被溶液中的分子向各个方向散射。散射光的强度与摩尔质量，浓度和折射率增量或dn / dc成比例。因此，通过测量光散射强度，您可以直接计算溶液中这些分子的摩尔质量。

同时在多个角度测量光散射。这很重要，因为散射角的变化与该分子的大小成正比，可用于确定分子或粒子的半径，这对于理解较大的DNA和mRNA分子至关重要。

第一个案例研究表明，通过分析溶液中存在的每种物质，使用MALS和尺寸排阻色谱(SEC-MALS)来表征DNA和蛋白质的复合物。第二个案例研究使用CG-MALS直接测量溶液中复合物的结合亲和力和化学计量。

SEC-MALS如何用于生物复合物的研究?

有时，即使HPLC或UHPLC分离是理想的，仅基于洗脱时间估计的样品的摩尔质量与标准品的摩尔质量不匹配。当样品和标准品具有不同的密度和不同的构象时，会出现这种不匹配。

在SEC-MALS中，来自HPLC或UHPLC柱的流出物流入UV检测器，我们的多角度光散射检测器和折射率(RI)检测器。UV或RI检测器提供浓度测量，其与MALS强度数据一起用于计算真实的摩尔质量。MALS测量还通过揭示峰在摩尔质量方面是否均匀或非均相来证实溶液已完全分离。

对于由两种不同类型的分子组成的复合物，这种分析并不那么简单。每个组件具有不同的消光系数和不同的dn / dc。在这种情况下，我们需要应用“蛋白质结合物分析”，其使用所有三种检测器直接确定我们复合物中每种组分的量。

使用UV和RI检测器测量浓度，得到每种组分的质量分数和摩尔质量。该技术有多种应用，例如糖基化或聚乙二醇化蛋白质，或用肽或核酸功能化的多糖。甚至可以表征非共价复合物，例如与膜蛋白质相关的脂质的量，或者在我们的情况下是蛋白质 - 核酸复合物。

这在SEC-MALS案例研究中如何应用?

SEC-MALS和蛋白质结合物分析方法已应用于原型泡沫病毒(PFV)整合酶和病毒DNA的复合物，称为intasome。

使用UV和RI同时获得的PFV整合酶的消光系数几乎是我们基于序列所预期的一半，但是用RI浓度和UV浓度测量摩尔质量证实它是正确的。这已经是关于有助于确定摩尔质量的复合物的有用信息。

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接下来，使用光散射，UV和RI信号计算色谱图中每个点的每个部分的摩尔质量和质量分数。

这表明蛋白质部分约为90%，意味着90%的质量是蛋白质，约10%是DNA。根据这些信息，我们得到了整个复合体的dn / dc和整个复合体的消光系数。我们用这个浓度和这个dn / dc来计算摩尔质量。总摩尔质量为194千道尔顿，因此我们知道蛋白质部分是174千道尔顿，DNA部分是约20千道尔顿。这相当于整合酶的四聚体和两条与细胞结构相匹配的DNA链。

观察到峰的摩尔质量不是恒定的，表明蛋白质四聚体的解离可能在分离过程中发生或某些物质可能不饱和。下一个案例研究显示了我们如何在解决方案中测量这些亲和力和化学计量。

那么CG-MALS与SEC-MALS有何不同?

CG-MALS是一种技术，可以让我们测量溶液中形成的配合物的亲和力和化学计量。

与之前的案例研究不同，MALS适用于未分级的样本。将一系列不同组成的样品注入光散射和浓度检测器中，以便我们可以使用MALS来确定每种组合物的摩尔质量。然后，摩尔质量的变化可以与溶液中络合物的形成有关。

通过这种方式，我们可以评估单体和二聚体以及二聚体和三聚体之间的自缔合和平衡。通过测量作为浓度函数的摩尔质量，我们可以确定自缔合亲和力和化学计量。

如果没有形成络合物，则摩尔质量将作为浓度的函数保持恒定。随着二聚体和三聚体等复合物的形成，我们发现摩尔质量随浓度的增加而增加。使用适当的模型，我们可以适应这种增加，告诉我们关联的亲和力和化学计量。

相同的技术可以应用于两种不同物种之间的相互作用。该组合物仅包括不同浓度的两种物质。我们在每个物种过量时进行测量，因此我们可以对该相互作用的整个化学计量进行采样。

随着络合物的形成，该溶液的摩尔质量增加，产生特征曲线。结合的复合物越多，相互作用越强。这使得峰值更高且更清晰。

此外，峰的位置告诉我们溶液的化学计量。如果物种B具有物种A的一个结合位点，我们将看到峰摩尔比为1：1的顶点。如果每个B可以结合两个A分子，我们将看到摩尔比为2：1的最大值，依此类推。

此外，由于CG-MAL技术直接测量摩尔质量，我们可以分辨出1：1和2：2相互作用之间的差异。它们都会在同一位置达到最大值，但我们仍然可以区分，因为2：2复合物的摩尔质量是两倍。

在您的第二个案例研究中使用CG-MALS研究了哪个复合体?

CG-MALS用于研究与loxP DNA识别位点复合的Cre重组酶。

首先，我们使用Cre的浓度梯度来测量单独的蛋白质的摩尔质量并确定它是否自我关联。对DNA本身进行了类似的测试。对五种不同浓度的每种分子进行MALS测量。

每个分子的摩尔质量在整个浓度范围内没有增加，表明它们根本不是自缔合的。Cre给出恒定摩尔质量为39千道尔顿，这与单体一致，并且DNA摩尔质量测量为恒定的23千道尔顿，其也是单体。

然后研究酶和DNA之间的关联。在MALS流动池中分析13种不同浓度的蛋白质和DNA的混合物。随着Cre / loxP络合物的形成，光散射强度的增加与摩尔质量随时间的增加成比例。

发现平衡时的摩尔质量约为110千道尔顿。这立刻告诉我们，化学计量比大于1：1，因为39加23只是62。

峰值位于2：1结合比的正确位置，但摩尔质量仍然大于这种复合物的应用，表明形成了一些更高级的结构，而不是标准的1：1或2： 1复杂。这得到了DNA与蛋白质的高比例的曲率的支持，该蛋白质未被简单的2：1模型捕获。

摩尔质量的测量表明实际上存在三种不同的络合物。第一个是与DNA结合的Cre蛋白，这种第一个结合发生的平衡解离常数为170纳摩尔。

然后第二个Cre以合作的方式与该复合物结合。一旦一种Cre蛋白与DNA结合，对第二种Cre蛋白的亲和力就会增加。最后，该Cre-loxP杂四聚体以400纳摩尔的亲和力二聚化。

单个CG-MALS实验探索每种物种仅几百纳摩尔的浓度，因此使我们能够完全描述这种三步结合机制。

没有必要在多种浓度方案中工作或假设这些结合位点中的一个或多个完全饱和，或者该反应的一部分可忽略不计。只需一次实验，您就可以获得完整的表征并测量所有特征。

您不仅可以获得亲和力和化学计量，而且CG-MALS还可以为您提供每种混合物的溶液组成。

您能否简要介绍两个案例研究?

是的，希望，我还表明光散射，无论是分馏还是分批模式，都不仅仅适用于蛋白质。这些相同的分析对于DNA和RNA以及用于表征与其他分子复合的核酸是至关重要的。

这两个案例研究强调了使用MALS可以获得的类似蛋白质/ DNA系统的两种不同类型的特征。

具有蛋白质缀合物分析的SEC-MALS给出了与其DNA配体结合的病毒整合酶的绝对摩尔质量和蛋白质和DNA部分。这是在没有摩尔质量标准的情况下完成的，并且没有假设化学计量学。

在没有色谱的分批模式下CG-MALS允许我们在多步蛋白质/ DNA相互作用中量化该复合物的亲和力和化学计量。相互作用分析不需要标记或固定。

我们的读者可以去哪里了解更多信息?

如需了解更多信息，请访问我们的网站 -www.wyatt.com/SEC-MALS和www.wyatt.com/CG-MALS。

关于Sophia Kenrick

Sophia Kenrick博士是Wyatt Technology的高级应用科学家，她支持Wyatt仪器的多种应用，特别是在分子识别和生物分子相互作用领域。

Sophia担任分析服务总监和圣巴巴拉校区光散射大学院长。

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