科学家在CRISPR-Cas防御系统中发现了Cas4蛋白的功能

全球各地的研究人员越来越多地使用名为CRISPR-Cas9的细菌防御机制作为手术编辑活细胞中DNA的工具。这项新技术使基因编辑更容易，更精确。但这些系统在自然界中如何发挥作用仍未完全了解。代尔夫特理工大学的研究人员现已确定了许多CRISPR系统中涉及的蛋白质之一的作用，即Cas4。事实证明，这种蛋白质有助于形成入侵病毒元素的记忆，从而保护细菌细胞免受病毒感染。使用Cas4获得的病毒记忆有助于细胞快速发现并摧毁入侵病毒以生存。该发现是朝着完全理解CRISPR系统迈出的又一重要步骤。

人眼不可能看到，但病毒和细菌彼此交战。每天，称为噬菌体的微小病毒样颗粒会杀死地球海洋中约三分之一的细菌。“这些病毒将DNA或RNA注入细菌细胞，试图控制它，”代尔夫特理工大学的Stan Brouns博士解释道。“如果这种劫持成功，病毒就可以将这种细菌用作生产自身副本的小工厂。”

遗传记忆

作为对抗病毒的进化，进化已经为细菌配备了防御机制，例如CRISPR-Cas9，它具有切割病毒DNA的能力，从而中和了威胁。然而，在此之前，细菌需要具有病毒的遗传记忆。它必须承认病毒是一种威胁。

这样的记忆形成为细菌抓住病毒DNA的片段并将其插入其自身的遗传密码中。如果同一类型的病毒再次攻击细菌，细胞会识别入侵者并派遣一种切割蛋白，例如Cas9。使用病毒片段的RNA拷贝作为一种“作弊表”，蛋白质开始狩猎 - 并摧毁病毒，保持细菌安全。

病毒DNA片段

科学家已经知道每种CRISPR系统都涉及几种蛋白质。然而，到目前为止，称为Cas4的蛋白质的作用尚不清楚。“我们知道它必须是重要的，因为这种蛋白质存在于大多数CRISPR系统中，”博士说。候选人Sebastian Kieper，曾与CristóbalAlmendros一起领导该项目。

为了找出Cas4实际上做了什么，科学家们在含有主要CRISPR记忆形成机制的大肠杆菌细胞中引入了Cas4基因。在其他细胞中，他们没有引入这种基因。布朗斯：“我们发现，在没有Cas4的情况下，细菌仍然形成了入侵者的记忆，但这些记忆并没有提供保护。”换句话说，只有当存在Cas4时，入侵DNA的片段才被插入到实际赋予细菌细胞病毒抗性的细菌基因组中。

功能记忆

进一步的研究揭示了为什么细菌不能使用它们形成的记忆而不使用Cas4。这与PAM(Protospacer Adjacent Motifs)有关，短序列由少量碱基对组成，这些碱基对作为蛋白质如Cas9的识别点。“任何使用Cas9进行基因组编辑的人都知道选择PAM对于实验的成功至关重要，”Brouns说。

细菌面临同样的问题。“当选择一片DNA插入细菌基因组作为记忆时，CRISPR系统需要选择一个侧翼为PAM的序列，”Brouns解释说。“Cas蛋白将利用PAM序列找到它的靶标。它不会靶向不被PAM侧翼化的DNA序列。”因此，PAM也起到保护作用，阻止Cas蛋白切割细菌自身的DNA。

Cas4的作用是确保只将侧翼为PAM的序列插入细菌的DNA中。当病毒再次试图攻击细菌时，这会导致实际上可以使用的功能记忆。

研究人员现在正在研究这一过程的工作原理，以及如何利用这一发现。也许适应性免疫可以引入除自然不具有CRISPR防御系统的微生物之外的生物体中。

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