正如医生寻求用超声波检查，CT和MRI扫描更深入身体，天文学家利用太空望远镜，自适应光学器件和不同波长的光线寻求进一步观察宇宙，神经科学家寻求新的方法来观察脑细胞深入大脑内部。最近出现了三光子显微镜，让他们比以往更深入地了解脑细胞。现在，基于对该技术的实质性改进，麻省理工学院的科学家们已经开展了第一项研究，通过每个视觉皮层，特别是下面神秘的“亚板”，唤醒老鼠的刺激神经活动。

“通过优化光学设计和其他参数，以便在大脑中进行测量，我们能够实际制作以前无法实现的新发现，”共同通讯作者，皮科尔研究所牛顿神经科学教授Mriganka Sur表示。学习和记忆。该论文的共同主要作者是博士后Murat Yildirim和Hiroki Sugihara。另一位通讯作者是机械工程和生物工程教授Peter So。

“这个概念已经存在，但问题是你如何让它发挥作用，”苏尔说。

该研究发表在Nature Communications上，研究小组表明，当老鼠观察视觉刺激时，他们的人类观察者可以测量所有六层视皮层和亚板中神经元之间的活动模式，提供有关它们在哺乳动物如何处理中的作用的新数据视力。此外，通过一系列仔细的实验​​，研究人员能够证明他们发出的光线，以及回来的光线，既没有损坏，也没有改变他们测量的细胞。

总之，本文描述了一种新型三光子显微镜，该显微镜经过优化，能够提供快速，短，低功率的光脉冲，能够在不引起任何功能性干扰或物理损伤的情况下到达深部目标，然后检测由细胞发出的荧光。高效率地生成具有清晰分辨率和快速帧速率的图像。

“我们有动力展示我们可以用三光子显微镜技术处理清醒状态下的动物，这样我们就可以提出神经科学的重要问题，”Yildirim说。“你可以认为你拥有世界上最好的显微镜，但在你问这些问题之前，你不知道你会得到什么结果。”

飞秒和纳焦耳

多光子显微镜背后的理论可以追溯到1931年Maria Goeppert-Mayer的博士论文，他的研究表明，低能光子的同时组合可以将原子或分子激发到更高的能量状态，就像单个更高能量的光子一样可以。1990年，康奈尔大学的科学家们将这种洞察力应用于双光子显微镜中的生物成像，并在2013年再次应用三光子示波器。这些允许神经科学家更深入地观察大脑，因为较低能量，较高波长的光子比较高能量，较短波长的光子更不容易被细胞分子如脂质散射。

Sur和So在麻省理工学院的实验室加入了推动多光子显微镜的前沿。在新的研究中，他们表明他们现在已经足够远，可以研究活体神经活动。为此，该团队试图根据他们成像的脑组织特性的细致测量，改进激光和示波器光学系统的许多不同参数。例如，他们不仅测量了细胞开始显示明显损伤的能量(约10纳焦耳)，还测量了细胞开始表现不同的能量，从而产生受测量影响的数据(2至5纳焦耳) 。凭借精确度和目的，提供更低的能量水平，科学家优化了范围，发出令人难以置信的短脉冲光，持续时间仅为40毫秒的“脉冲宽度”，

史无前例的神经科学

在仔细验证优化的三光子示波器的测量结果与双光子示波器(在皮层较浅的层)和电生理学(可以更深入，但是盲目地)的测量结果一致之后，该团队开始做一些前所未有的神经科学 - 直接目视观察清醒，表现动物的所有皮层中的神经活动。

在实验室中，他们向小鼠显示了12个不同旋转方向的一些光栅图案和屏幕上的两个运动方向。通过优化的三光子范围，他们观察了皮层每层中的神经元 - 超过一毫米深 - 看看细胞如何对这种标准视觉输入作出反应。他们可以看到细胞的活性，因为他们使用名为GCaMP6s的标签将它们设计为在钙活性升高时发光。他们可以通过称为“三次谐波产生”的现象看到其他组织，如血管和白质。

他们能够看到最深的层，他们观察到第5层神经元被“广泛地”调整为方向，这意味着它们可以响应各种各样的方向，而不仅仅是一个或两个特定的方向。第5层神经元也比其他层中的细胞具有更多的自发活动，并且与大脑更深部分的连接更多。同时，第6层神经元的定向调整比其他层中的神经元稍微更清晰，这意味着它们对不同方向的响应更具特异性。

Subplate惊喜

他们最令人惊讶的发现是，亚板是一层薄薄的神经“白质”纤维，是一群神经元的家园，其活动模式微弱且广泛地适应视觉输入。研究人员说，这一发现具有启发性，因为许多神经科学家认为，亚板神经元在发育过程中大多只是活跃的。Yildirim说，这层也太薄了，用电生理学测量。

“到目前为止，由于在体内成像这些细胞的技术挑战，成熟大脑中的亚板神经元尚未被研究过，”研究人员写道。

Sugihara回忆起Yildirim第一次向他展示亚板神经元在成熟小鼠中是活跃的。“他们在那里做什么?” 他回忆起惊讶地问道。

现在他们继续使用他们的新范围来回答这个问题。

美国国立卫生研究院，国家科学基金会，Picower研究所工程合作拨款和马萨诸塞州生命科学倡议支持该研究。