许多未培养的微生物在调节地球的生物地球化学过程中扮演着不为人知的角色; 从调节植物健康到在陆地和海洋环境中驱动养分循环，这些过程都可能影响全球气候。虽然研究人员正在利用多种方法来识别这些被称为“微生物暗物质”的微生物，并确定它们正在做什么，但大多数技术都不允许它们同时进行这两种微生物。

在一项研究在线发表2016年6月28日，在国家科学学院院刊(PNAS)，研究人员在加利福尼亚技术学院(加州理工学院)和能源部联合基因组研究所，美国能源部(DOE JGI)的美国能源部办事处科学用户设施，利用最近改进的技术来识别个体活跃细胞，以及微生物群落内的活跃细菌和古细菌的单个聚类。了解地球微生物多样性的真实范围是DOE感兴趣的，以便了解如何利用它们来应对各种能源和环境挑战。

“探索微生物暗物质的最大问题之一是到目前为止，确定何时未培养的微生物具有代谢活性以及它们在系统中的生态功能是非常复杂的，”研究第一作者Roland Hatzenpichler说，他是一名博士后研究员在微生物生态学家Victoria Orphan的加州理工学院实验室工作。作为DOE生物与环境研究(BER)计划的一部分，Orphan的实验室一直在研究未培养微生物的生态学和生理学，催化环境中甲烷的厌氧氧化。“当我们处理生活在复杂社区内的环境或寄主相关生物 - 通常同时发生数千种或更多种 - 时，很难确定个体物种或细胞的作用。从历史上看，这已经使用单细胞分辨同位素标记完成。这是一种相对繁琐且昂贵的方法，但是非常具体和敏感。但是，如果我们想要更好地了解微生物组的功能，我们需要新的，互补的方法，这些方法具有更高的吞吐量，可以并行化，而且价格便宜。BONCAT [新技术]就是这样一种方法。“

BONCAT：了解微生物体功能的高通量技术

短为乙 IO ø rthogonal Ñ导通Ç anonical 甲美浓酸Ťagning，BONCAT是加州理工学院开发的用于生物工程研究的技术，但由Hatzenpichler和Orphan改编用于微生物生态学研究。BONCAT使用合成氨基酸标记蛋白质制造细胞。然后可以用荧光标签染色这些氨基酸，点亮其栖息地中的活性细胞。在这项研究中，Hatzenpichler及其同事使用从俄勒冈州和加利福尼亚州海岸外的深海甲烷渗漏沉积物中收集的沉积物样本进行了一系列孵化实验，追踪甲烷代谢细菌和古菌种群的缓慢生长。这些沉积物中的微生物群落包括甲烷氧化古菌的聚集体，称为ANME(用于AN有氧ME)(生物多样性)和硫酸盐还原菌(SRB)共生共存，有助于去除海洋沉积物释放的80%甲烷。

加州理工学院的研究人员将BONCAT与荧光原位杂交(FISH)相结合，分析这些模拟环境中的活性微生物，并确定它们在哪些条件下具有活性。“通常情况下，每个甲烷渗漏点都有几个不同的古菌甲烷氧化剂，”Hatzenpichler说。“一个长期存在的假设是，来自这些群体的不同成员在不同时期的活动不同。通过利用以相对高通量模式进行BONCAT分析的能力，我们发现所有甲烷氧化古菌群的成员在孵化过程中具有合成代谢活性。现在我们可以开始问为什么了。“

应用BONCAT技术进行流式细胞术

然后，DOE JGI研究人员帮助开发了一个流程，使团队能够将BONCAT应用于流式细胞仪。“这与单细胞基因组学相同，但对于共生细菌和古细菌的聚集，”DOE JGI微型应用小组负责人Rex Malmstrom称该技术称为BONCAT-FACS(BONCAT - F luorescence - A ctivated C ell S奥廷)。“我们正在对单个聚合体进行分类，这些聚集体中充满了在模拟环境中活跃的细胞，并且通过细胞分选仪，我们可以抓取活性细胞来研究它们。我们必须弄清楚如何调整流式细胞仪的过程。在分选后，我们对单个聚集体进行全基因组扩增，然后对16S rRNA标记基因进行测序以鉴定包含聚集体的细胞。我们现在正在对这些样本进行全基因组测序。“测序可以为研究人员提供遗传信息，解释为什么有些微生物在某些条件下是活跃的，为什么其他微生物不是。

通过BONCAT-FACS，研究小组发现，甲烷氧化古菌并不像已经预期的那样只与已知的硫酸盐还原菌相互作用，但有时也与研究较少的Verrucomicrobia门的成员联系起来。之前没有发现过这些相互作用，研究结果表明，甲烷氧化古菌具有比人们想象的更广泛的共生关系。目前正在解决这些相互作用是否对两种细胞类型都有益的问题。

“JGI的主要力量在于破译微生物遗传密码的能力，”Hatzenpichler指出。“通过合作，我们能够从样本中分离出与温室气体甲烷降解有关的单个细胞群，确定参与该过程的细胞伙伴，并深入了解其遗传密码。”Orphan和她的团队计划利用配对的甲烷氧化古菌和细菌伴侣的基因组信息，深入了解不同甲烷氧化菌群在环境中共存的相互作用和能量交换的生理学和机制。

秋季，Hatzenpichler将在蒙大拿州立大学博兹曼分校开设自己的实验室。他将继续与DOE JGI研究人员密切合作，揭示未培养微生物的生物地球化学影响和生物技术潜力。

这项工作得到了美国国家科学基金会暗能生物圈研究中心，戈登和贝蒂摩尔基金会，奥地利科学基金和美国能源部科学办公室的支持。