江苏农业科学２０１７年第４５卷第１２期　一７３一　

赵亚男，王晓东．环境因素对哈密瓜细菌性果斑病病菌生物膜形成的影响［Ｊ］．江苏农业科学，２０１７，４５（１２）：７３—７６　

ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２—１３０２．２０１７．１２．０１９　

环境因素对哈密瓜细菌性果斑病病菌　

生物膜形成的影响　

赵亚男，王晓东‘　

（石河子大学绿洲农作物病害防控重点实验室，新疆石河子８３２０００）　

摘要：为研究哈密瓜细菌性果斑病病菌（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ　ａｖｅｌｌ￣ｅ　ｓｕｂｓｐ．ｃｉｔｒｕｌｌｉ，简称Ａａｃ）在不同培养条件下形成生物膜　

的能力，选用微孔板体外培养、结晶紫染、分光光度测定法检测哈密瓜细菌性果斑病病菌在不同载体、培养基、培养　

温度、培养时间、葡萄糖浓度、初始ｐＨ值条件下生物膜的形成能力。结果发现，在１１种供试载体中，Ａａｃ在聚苯乙烯　

表面易形成稳定、明显的生物膜；在供试的６种培养基中，牛肉膏蛋白胨培养基（ＬＢ）形成生物膜能力最强；以ＬＢ为培　

养基、聚苯乙烯孔板为载体、初始ｐＨ值为７、培养温度２８　ｏｃ、培养２４　ｈ、葡萄糖浓度为３０．０　ｍｍｏｌ／Ｌ时，Ａａｃ形成生物　

膜能力最强。结果表明，不同载体、培养基、培养温度、培养时间、葡萄糖浓度、初始培养ｐＨ值均对Ａａｃ生物膜形成能　

力有明显影响。研究结果能为有效阻止Ａａｃ生物膜形成、有效防治哈密瓜细菌性果斑病病菌提供理论依据。　

关键词：哈密瓜细菌性果斑病病菌；生物膜形成能力；培养条件　

中图分类号：Ｓ４３６．５　文献标志码：Ａ　文章编号：１００２—１３０２（２０１７）１２—０ｏ７３—０４　。　

瓜类细菌性果斑病由燕麦种西瓜亚种（Ａｃｉｄｏｖｏｒａ　ａｖｅｎａｅ　的耐药性，减少细菌分泌毒性因子，提升抗生素的抑菌效能，　

ｓｕｂｓｐ．ｃｉｔｒｕｌｌｉ，简称Ａａｃ）引起，是一种严重的检疫性病害…。　

将大大提高细菌病害防治效果，同时也可缓解因滥用抗生素　

它具有发病快、危害重、防治难等特点，给哈密瓜的安全生产　等农药引起的环境安全问题。本试验通过测定哈密瓜细菌性　

造成了严重威胁，目前尚未发现免疫的哈密瓜品种　Ｊ。在　

果斑病病菌在体外不同培养条件下形成生物膜的能力，以期　

生产中长期和大量使用铜制剂、抗生素会导致环境安全、病原　了解哈密瓜细菌性果斑病病菌生物膜形成的干扰因素，为有　

菌耐药性问题的产生　。在自然或人工条件下，许多细菌主　

效防治哈密瓜细菌性果斑病提供新思路。　

要以生物膜形式存在　。植物生境相关细菌生物膜的形成　

不仅对植物健康造成严重影响，同时也是植物一病原物互作　

１材料与方法　

中具有毒性作用的致病因子　。铜绿假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　１．１材料　

ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）在紫花罗勒根部形成生物膜而引起病害，使受感　１．１．１供试培养基细菌培养基为营养肉汤（ＮＢ）、胰蛋白　

染植物７　ｄ内死亡，根癌土壤杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）　胨大豆肉汤（ＴＳＢ）、牛肉膏蛋白胨培养基（ＬＢ）、酵母浸出粉　

在寄主根部形成生物膜，有利于其将毒性质粒注入寄主体内　胨葡萄糖液体培养基（ＹＰＤ）、金氏培养液（ＫＢ）、Ｍ２１０培　

引起根癌病－－，　。植物病原细菌柑橘溃疡病病菌生物膜在其　养基。　

定殖和病害循环中起重要作用　。细菌生物膜（ｂｉｏｉｆｌｍ，简称　１．１．２供试菌株　供试菌株瓜类细菌性果斑病病菌菌株　

ＢＦ）是由细菌体感应（ｑｕｏｒｕｍ　ｓｅｎｓｉｎｇ，简称Ｑｓ）调控产生的　ＸＪ０５—１（Ａａｃ）由石河子大学植物保护系王晓东提供。Ａａｃ接　

生理效应（如生物膜、分泌毒性因子、集运动等）之一。是通　种于ＫＢ培养基中，２８℃恒温培养３６　ｈ后备用。　

过胞外基质（蛋白质、多糖、脂肪等）聚集附着于生物或非生　１．１．３　主要仪器及试剂　Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ酶标仪（Ｆｃ）、ＦＥ２０　ｐＨ　

物表面形成的具有复杂结构的落　。处在成熟生物膜　计、ｕＶ一１８００紫外可见分光光度计、ＤＮＰ一９２７２电热恒温培　

中的细菌对抗生素的耐受性是浮游细菌的１００～１　０００倍，细　养箱、９６孔板、１２孔板、葡萄糖（分析纯）。　

菌形成生物膜后，可通过限制药物渗透使药物在生物膜内无　１．２方法　

法达到有效抑菌浓度或影响生物膜内ｐＨ值而影响药物的解　１．２．１　Ａａｃ菌悬液的制备挑取少量Ａａｃ划线于ＫＢ培养基　

离度等机制，从而降低抗生素的抑菌效能，明显增强细菌的耐　上，２８℃培养３６　ｈ后，用无菌水清洗培养物，制备３×　

药性…　。因此，抑制或影响细菌生物膜的形成，降低细菌　１０　ＣＦＵ／ｍＬ（Ｄ６ｏｏ　＝１．０）Ａａｃ菌悬液。　

１．２．２　Ａａｃ成膜的检测对生物膜的测定参照文献［１４—　

收稿日期：２０１６—１２—１２　

１５］描述的方法并略有改动。将浓度为３×１０　ＣＦＵ／ｍＬ　

基金项目：国家自然科学基金（编号：３１４６０４８５）。　

（Ｄ　：１．０）的Ａａｃ菌悬液３５　接种于装有１００　培养　

作者简介：赵亚男（１９９２～），女，河南商丘人，硕士研究生，主要从事　

基的９６孔板中，每个测试样品６次重复。２８℃静置培养　

植物病害生物防治研究。Ｅ—ｍａｉｌ：６１９０２０３５３＠ｑｑ．ｅｏｍ。　２４　ｈ后用超纯水润洗孔板３次，加入２００　ＩＬＬ　０．４％结晶紫染　

通信作者：王晓东，博士，副教授，主要从事植物病害生物防治研究。　３０　ｍｉｎ，去掉染液，润洗直至流出液澄清，最后用２００　Ｌ纯　

Ｅ—ｍａｉｌ：ｗｘｄａｇｒ＠ｓｈｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。　乙醇溶解，振荡，测定Ｄ　。　

７４－－——　江苏农业科学２０１７年第４５卷第ｌ２期　

２０．０、３０．０　ｍｍｏｌ／Ｌ）ＬＢ培养基的９６孔聚苯乙烯微量孔板中，　

２８℃静置培养２４　ｈ，测试生物膜的形成能力。　

１．２．３　Ａａｃ在不同培养条件下生物膜形成的测定　试验载　

体：取７００　浓度为３×１０　ＣＦＵ／ｍＬ菌液加入含有２　ｍＬ　ＫＢ　

培养液的ｌ２孔板中，分别将无菌处理后表面光滑的不锈钢片　

（网状不锈钢片）、表面粗糙的不锈钢片、玻璃片、聚苯乙烯　

初始ｐＨ值：取３５　浓度为３　Ｘ　１０　ＣＦＵ／ｍＩ　菌液加入　

含有１００　ＩＬＬ　ｐＨ值分别为９、８、７、６、５、４、３、２的ＬＢ培养基中，　

片、铝片、铁片、铜片、木条、锡纸、胶片、陶瓷片斜插入１２孔　

板中，２８℃静置培养２４　ｈ，测试生物膜形成能力。　

培养基：向９６孔聚苯乙烯微量孔板中分别加入１００　ＩＬＬ　

ＴＳＢ、ＫＢ、ＹＰＤ、Ｍ２１０、ＮＢ、ＬＢ培养基，再加入３５　Ｌ浓度为　

３×１０　ＣＦＵ／ｍＬ菌液。２８℃静置培养２４　ｈ，测试生物膜形成　

能力。　

在９６孔聚苯乙烯微量孔板中２８℃静置培养２４　ｈ，测试生物　

膜的形成能力。　

１．３数据统计与分析　

采用ＳＡＳ　８．０软件中的方差分析程序（ＡＮＯＶＡ）分析上　

述各试验处理问的差异显著性。比较各处理问的差异采用　

Ｄｕｎｃａｎ’ｓ新复极差法。　

２结果与分析　

培养时间：向装有１００　ＩＬＬ　ＬＢ培养基的９６孑Ｌ聚苯乙烯微　

量孔板中加入３５　Ｌ浓度为３×１０　ＣＦＵ／ｍＬ菌悬液。在　

２８　ｑＣ条件下静置培养６、８、１０、１２、２４、３６、４８、６０　ｈ后，测试生　

物膜的形成能力。培养温度：向装有１００　ＩＬＬ　ＬＢ培养基的９６　

孔聚苯乙烯微量孑Ｌ板中加入３５　Ｌ浓度为３×１０　ＣＦＵ／ｍＬ菌　

２．１　不同附着材质对Ａａｃ形成生物膜的影响　

由图ｌ可见，Ａａｃ在表面光滑的不锈钢片（Ｅ）、表面粗糙　

的不锈钢片（Ｇ）、玻璃片（Ｋ）、聚苯乙烯片（ｃ）、铝片（Ｄ）、铁　

片（Ａ）、铜片（Ｈ）、锡纸（Ｂ）、陶瓷片（Ｊ）表面可以形成生物　

膜，在胶片（Ｆ）、木条（Ｉ）上无法形成生物膜，在聚苯乙烯片　

上形成的生物膜明显、厚、稳定。　

悬液。分别在１８、２３、２８、３３℃条件下静置培养２４　ｈ，测试生　

物膜的形成能力。　

葡萄糖浓度ｌ取３５　浓度为３×１０　ＣＦＵ／ｍＬ菌液加入　

到含有１００　Ｉ．ｔＬ不同浓度葡萄糖（０．０、５．６、７．０、１１．１、ｌ６．７、　

Ｃ　

图１　不同载体对Ａａｃ生物膜形成的影响　

２．２培养基对Ａａｃ形成生物膜的影响　

由图２可得，Ａａｃ在６种培养基中均可形成生物膜，其中　

２．３培养时间对Ａａｃ形成生物膜的影响　

由图３可得，Ａａｃ生物膜在形成初期，Ｄ　随着时间的　

延长逐渐提高，在２４　ｈ时Ｄ　达到最高值，这时生物膜形成　

能力最强，而后随着培养时间的延长，Ｄ　逐渐下降，生物膜　

的形成能力逐渐减弱。　

Ａａｃ在ＬＢ培养基中形成生物膜能力最强，Ｄ，　最高，显著高　

于除ＹＰＤ培养基外的其他试验组，在ＮＢ培养基中形成生物　

膜的能力最弱。　

，盲　

景　

ｇ　

Ｒ　

铬　

鳘　

划　

０　

６　８　１０　１２　２４　３６　４８　６０　

时间（ｈ）　

图３培养时间对Ａａｃ生物膜形成的影响　

江苏农业科学

２．４培养温度对Ａａｃ生物膜形成的影响　

２０１７年第４５卷第１２期　一７５—　

膜形成能力的影响发现，成膜载体、培养基、时间、温度、葡萄　

（珊。　（７）　ｇ鹫　划　

糖浓度、初始ｐＨ值对其成膜能力均有影响。试验结果显示，　

由图４可得，Ａａｃ在ｌ８、２３、２８、３３℃条件下均可形成生物　

１　ｌ　１　０　Ｏ　０　０　膜，形成生物膜能力随着温度的升高而增强，在２８　时，　

４　２　Ｏ　８　６　４　２　Ｏ　

每ｎ口）　攫镁　窨趟　

在１１种供试载体中，Ａａｃ在聚苯乙烯片上易形成明显、稳定　

的生物膜；６种供试培养基中，Ａａｃ在ＬＢ培养基中形成生物膜　

的能力最强，Ｄ　＝２．０５；以ＬＢ为培养基、聚苯乙烯孔板为　

培养载体，初始培养ｐＨ值为７、葡糖糖浓度为３０．０　ｍｍｏｌ／Ｌ、　

培养２４　ｈ时成膜能力达到最强，所检测的Ｄ　。　分别为　

１．３４、１．９８、１．３０。　

Ｄ　。　达到最大值，随后温度升高，Ｄ，　下降，即生物膜形成　

能力减弱。　

不同温度下，Ａａｃ形成生物膜的能力是不同的。１８～　

２８℃时，Ｄ　随温度升高逐渐提高，Ａａｃ生物膜形成能力逐　

ｌ８　２３　２８　３３　

培养温度（℃）　

图４培养温度对Ａａｃ生物膜形成的影响　

２，５初始ｐＨ值对Ａａｃ生物膜形成的影响　

由图５可得，Ａａｃ在初始ｐＨ值为５…４　３　２时几乎无法形　

成生物膜，Ｄ　。　接近０；当初始ｐＨ值为７时，检测的Ｄ，　。　最　

高，生物膜形成能力最强；在初始ｐＨ值为８—９时，Ｄ　。　逐　

渐降低，生物膜形成能力减弱。　０１　　０　．８６４２｝ｆ　ｌ口ｃ　口Ｃ　口Ｃ　口Ｃ　们ｆＪｌＩ　ｂｌＩＵ　１Ｊｆｌ『ＩＵ　ｂＪｆＪｌＵ　ｂ１ｆ

２．６　葡萄糖浓度对Ａａｃ形成生物膜的影响　

由图６可得，Ａａｃ在葡萄糖浓度为０时形成生物膜的能　

力最弱，随着葡萄糖浓度的增加，形成生物膜的能力逐渐增　

强，在葡萄糖浓度为３０．０　ｍｍｏｌ／Ｌ时，Ｄ　最大，形成生物膜　

能力最强。　

日　

景２．０　

Ｑ　

１．５　

餐　

１．０　

荨。一ｓ　

Ｏ　

０　５．６　７．０　１１．１　１６．７　２０．０　３０．Ｏ　

葡萄糖浓度（ｅｒｏｔｏｌ／Ｌ）　

图６葡萄糖浓度对Ａａｃ生物膜形成的影响　

３结论与讨论　

本试验研究了环境因素对哈密瓜细菌性果斑病病菌生物　

渐增强。彭晓云等在不同培养条件下对金黄葡萄球菌生物　

膜生长影响试验中发现，温度与生物膜呈依赖关系，随着温度　

的升高，ＢＦ表面积增大　。但本研究发现，当Ａａｃ培养温度　

达到３３℃时，Ｄ　减小，反而抑制了成膜能力。温度过高，　

可能使细胞组分（蛋白质、核酸等）产生不可逆的失活，丧失　

细胞功能，对生物膜的形成有一定的影响　。　

国外学者Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ发现，只要存在能合成胞外多糖的　

微生物菌属，就能形成成熟、稳定的生物膜　。并且研究表　

明，菌体黏附后生成的水不溶性多糖也有利于促进菌体间的　

聚集和维持生物膜的三维结构　。本试验在检测不同葡萄　

糖浓度对哈密瓜细菌性果斑病菌生物膜形成的影响中发现，　

在不含有葡萄糖的培养基中，Ａｏｆ形成生物膜的能力最低；随　

着葡萄糖浓度的增加，Ａａｃ形成生物膜的能力逐渐增强。葡　

萄糖浓度的增加促进了菌体间的相互黏附、聚集，增强了成膜　

能力。同时，杨虹等发现高浓度葡萄糖对鲍氏不动杆菌生物　

膜的形成能力、厚度有很强的促进作用　。　

在进行不同初始ｐＨ值对Ａａｃ生物膜形成的影响试验中　

发现，Ａａｃ在初始ｐＨ值低于６的环境里静置培养，成膜能力　

几乎丧失。初始ｐＨ值为７时，形成生物膜的能力最强，初始　

ｐＨ值为８～９时，Ａａｃ具有成膜能力，但逐渐减弱。刘文竹等　

研究发现，溶藻弧菌在ｐＨ值低于６的环境里，几乎无法形成　

生物膜，成膜能力受到明显抑制　。同时姜颖等研究也说　

明，低ｐＨ值条件下，培养的变形链球菌黏附力较弱，影响生　

物膜的形成　。细菌的体感应是细菌通过分泌可溶性信　

号分子来检测体密度并协调细菌生物功能的信息交流机　

制，为功能性生物膜的形成提供了保证。革兰氏阴性菌的ＱＳ　

系统主要由信号分子Ⅳ一酰基高丝氨酸内酯（Ｎ—ａｃｙｌ—ｈｏ—　

ｍｏｓｅｆｉｎｅ］ａｃｔｏｎｅｓ，简称ＡＨＬｓ）、ＡＨＬｓ合成酶Ｌｕｘ　Ｉ族蛋白、　

ＡＨＬｓ受体ＬｕｘＲ族蛋白组成　。作为Ｑｓ系统中的关键因　

子，ＡＨＬｓ可以调控细菌的生物膜形成、游现象、抗生素的　

合成等多种生理生化功能　。关于偏酸性的环境是否对Ａａｃ　

的体感应系统存在影响，这将是后续试验的重点。　

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（上拉接第６３页）　

ＲｃＭＹＢ基因在烟草中的成功表达有效地提高了转基因植株　

的抗旱性。本试验可为今后利用转基因技术提高烟草抗逆　

性，扩大其应用范围提供可行性依据，也为其他植物的抗逆性　

分子机制的研究提供理论参考。　

参考文献：　

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