中国医学装备2021年12月第18卷第12期ChinaMedicalEquipment2021DecemberVol.18No.12学术论著

基于超高压液相谱评价不同保存时间

*对人血浆免疫球蛋白GN-糖基化水平的影响

张杰①孟晓妮①王碧妍①张晓雨①王友信①董晶②赵志强③*

[文章编号]1672-8270(2021)12-0153-05[中图分类号]R446.1[文献标识码]A

[摘要]目的：

探讨超低温环境下不同储存时间对血浆免疫球蛋白G(IgG)N-糖基化水平的影响，以期为大规模流行病学调

查中有效保存样本提供帮助。

方法：

采用随机数表法收集超低温环境下(-80

℃)保存于2012年、2013年、2017年、2018年和

2019年5个年份的75份女性健康体检的血浆样本，并将其按照不同保存年限分为2012年组、2013年组、2017年组、2018年组

和2019年组。采用基于超高压液相谱平台，对5组血浆样本中的总体IgGN-糖基化水平进行高通量检测，分离出24个糖基

结构，并计算其衍生物结构含量。采用方差分析或秩和检验对不同储存时间组的糖基检测结果进行差异性比较。

结果：

对

超低温环境下不同保存时间保存的5组血浆样本中IgGN-糖基结构进行比较，24个糖基结构的检测其谱峰(GP1～GP24)

均无统计学差异；对5组样本中13个IgGN-糖基衍生物结构含量比较均无统计学意义。

结论：

超低温条件下，血浆样本存

储时间的长短对血浆中IgGN-糖基化水平未产生明显的影响。

[

关键词

]免疫球蛋白G(IgG)；N-糖基化；超高压液相谱(UPLC)；糖基衍生物；储存时间

DOI:10.3969/.1672-8270.2021.12.037

TheevaluationontheeffectsofdifferentstoragetimesonN-glycosylationlevelofimmunoglobulinGinhumanplasma

basedonUHPLC/ZHANGJie,MENGXiao-ni,WANGBi-yan,etal//ChinaMedicalEquipment,2021,18(12):153-157.

[Abstract]Objective:

ToinvestigatetheeffectsofdifferentstoragetimesontheN-glycosylationlevelofimmunoglobulin

G(IgG)ofhumanplasmaatultra-lowtemperature(-80

℃

)soastoprovidehelpforthepreservationofsamplesinlarge-

scaleepidemiologicalsurvey.

Methods:

Theplasmasamplesof75femaleswhowerehealthinphysicalexamination,

whichwerestoredin2012year,2013year,2017year,2018yearand2019year,wereselectedbyusingrandomnumber

yweredividedintogroup2012year,group2013year,group2017year,group2018yearandgroup

ra-performanceliquidchromatography(UPLC)wasadopted

toimplementhighthroughputtestforN-glycosylationlevelofIgGintheplasmasamplesof5groups.24glycosylation

structureswereisolated,ianceanalysisor

ranksumtestwereadoptedtoimplementdifferencecomparisonforthedetectionresultsofglycosylationatdifferent

storagetimes.

Results:

ThestructuresofIgGN-glycosylationintheplasmasamplesof5groups,whichwerestoredat

differentpreservationtimesunderultra-lowtemperature,werecompared,andthedifferencesofchromatographicpeak

(GP1-GP24)ferencesofthecontentsof13IgGN-glycosylation

derivativestructuresamong5groupswerenosignificant.

Conclusion:

Theintervalofstoragetimeoftheplasmasamples

hadnosignificanteffectontheIgGN-glycosylationlevelatultra-lowtemperature.

[Keywords]

ImmunoglobulinG(IgG);N-glycosylation;UPLC;Glycosylationderivative;Storagetime

[First-author’saddress]

BeijingMunicipalKeyLaboratoryofClinicalEpidemiology,SchoolofPublicHealth,Capital

MedicalUniversity,Beijing10069,China.

血浆免疫球蛋白G(immunoglobulinG，IgG)

N-糖基的特定谱型可及时反映机体多种生理和病理

改变[1]。异常的IgGN-糖基化水平，尤其是IgGN-

糖基衍生物半糖基化、唾液酸化、N-乙酰葡糖胺

化和核心岩藻糖基化的改变与高血压、血糖异常、中

心性肥胖、血脂异常、代谢综合征和缺血性脑卒中等

多种慢性疾病或其发生发展的危险因素存在关联[2-4]。

目前，IgGN-糖基化水平的变化与多种慢性疾病发

生发展的关联性研究正在成为国内外的研究热点[5-8]。

低温环境能长期保护样本中生物大分子的信息完

整性，维持细胞和组织活性，可以为医学科学研究提供

保障[9]。然而，低温保存对蛋白质的影响比较大，长时

间暴露于降温过程中可能会引起蛋白质结构的不可逆转

变[10]。为此，本研究通过对2012年、2013年、2017年、

2018年和2019年5个年份收集的健康体检人血浆样本

进行IgGN-糖基化水平检测，分析超低温(-80℃)储存

条件下储存时间对人血浆IgGN-糖基化水平的影响，

以期为大规模流行病学调查中样本的保存提供帮助。

*基金项目：国家自然科学基金(81872682)“痴呆症发生风险分层的免疫球蛋白GN-糖基组生物标志物筛选”

①首都医科大学公共卫生学院临床流行病学北京市重点实验室北京100069

②首都医科大学附属宣武医院体检科北京100053

③首都医科大学信息中心北京100069

*通信作者：**************.cn

作者简介：张杰，女，(1968-)，本科学历，副主任，从事分子流行病学研究工作。

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学术论著

1材料与方法

1.1仪器与试剂

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对人血浆免疫球蛋白GN-糖基化水平的影响*-张杰等

脱液移至新的96孔板中，用N-糖苷酶(N-glyeosidase

F)将与IgG结合的糖链消化下来；并用预冷的96%乙腈

将洗脱下来的糖链进行纯化；采用2-氨基苯甲酰胺

(2-aminobenzamide，2-AB)对洗脱下来的糖链进行

荧光标记。

(3)糖基结构检测。采用WatersAcquityH-Class

超高压液相谱系统对2-AB标记的IgGN-糖基进行

检测，荧光检测器的激发光波长为330nm，发射光波

长420nm。

(4)IgGN-糖基计算。用不同谱峰对应峰下面

积占所有谱峰峰下总面积的百分比表示，并进行标

准化处理。

(5)糖基结构鉴定。每个谱峰的含量被测定之

后，采用UPLC串联四级杆飞行时间质谱(quadrupole-

timeofflight-massspectrometry，quadrupole-TOF-

(6)糖基衍生物指标含量的计算。在测得的24个

谱峰基础上，根据糖基衍生指标的方法[13]计算得到IgG

N-糖基衍生物：总核心岩藻糖结构(Fuc)、总平分型

N-乙酰葡糖胺(N-GlcNAc)(Bis)、总半糖结构(Gal)、

单半糖结构(Gal-1)、总双半糖结构(Gal-2)、唾液

酸化结构(Sal)、单唾液酸化结构(Sal-1)、双唾液酸化结

构(Sal-2)、未唾液酸化的核心岩藻糖结构(nFuc)、未唾

液酸化的平分型N-GlcNAc(nBis)、未唾液酸化的半

糖结构(nGal)、未唾液酸化的单半糖结构(nGal-1)和

未唾液酸化的总双半糖结构(nGal-2)，共计13种。

1.4评价指标

观察IgGN-糖基水平，对比分析不同保存时间

的血浆样本中IgGN-糖基水平以及IgGN-糖基衍生

指标含量。

1.5统计学方法

采用SPSS24.0软件对数据进行统计分析，正态分

-

±

s

)表示，不满足正布的计量资料以均值±标准差(

x

(1)仪器设备。采用AcquityUPLC

1290型超高压

液相谱仪器(美国Waters公司)；BEH谱柱，糖基

层析柱(美国Waters公司)；5430R小型高速离心机(德国

Eppendorf公司)；186001831型96孔板真空提取装置(美

国Waters公司)；Concentratorplus型真空离心浓缩仪

(德国Eppendorf公司)；Milli-QAdvantageA10型纯

水仪(美国Millipore公司)；4672100型八道电动移液

器(德国Eppendorf公司)；150μl进样瓶套管(上海沃

特世科技有限公司)；ULT-1385-3-V型超低温冰箱

(美国ThermoFisher公司)。

(2)主要试剂。葡聚糖标准品(DextranCalibration

Ladder)(上海沃特世科技有限公司)；N-糖苷酶

(N-Glycosidase，100units，上海罗氏制药有限公

Labelingkit，美国Sigma公司)；聚乙氧基乙醇辛

基苯基-聚乙烯二醇(Igepal)-CA630，美国Sigma公

司)；二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)(美国

Sigma公司)；甲酸(美国Sigma公司)；乙醇(谱级化

学纯度＞99%，北京汇海科仪科技有限公司)、异丙醇

(北京汇海科仪科技有限公司)、Tris(三羟甲基氨基甲

烷，美国Sigma公司)；乙腈(谱级，北京汇海科仪

科技有限公司)、甲酸铵(北京迈瑞达科技有限公司)。

1.2样本收集

采用随机数表法收集分别存放在-80℃超低温环

境下，于2012年、2013年、2017年、2018年和2019年

5个年份收集并保存的首都医科大学附属宣武医院健

康体检的75名女性血浆样本，且将其按照不同保存

年限分为2012年组、2013年组、2017年组、2018年组

和2019年组，每组样本15份。5组体检者总平均年龄为

(40.93±9.16)岁，年龄差异无统计学意义，具有可

比性。

1.3血浆IgGN-糖基检测方法

根据已有文献[11-12]报道的方法对血浆IgGN-糖基

化水平进行定量检测，该方法是一种基于96孔G蛋白

单片板的高通量、自动分析技术，其检测步骤如下。

(1)血浆IgG提取及纯化。将血浆样本置于96孔蛋

白G提取板中，结合缓冲液清洗5次，以去除未结合的

蛋白。然后用甲酸溶液将IgG进行洗脱，用96孔板进

行收集并进行浓度测定.

(2)IgG上糖链的释放和标记。将标定浓度的IgG洗

154ZHONGGUOYIXUEZHUANGBEI

司)；糖蛋白2-AB标记试剂盒(GlycoProfile2-ABMS)方法对定量后的糖基进行具体结构的定性。

态分布的计量资料采用中位数和四分位数间距表示，

符合正态分布的计量资料组间比较采用单因素方差分

析，不符合正态分布的计量资料组间比较采用非参数

秩和检验，以

P

＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1IgGN-糖基的检测结果

根据亲水相互作用谱原理将不同结构的IgGN-糖

基进行分离，利用荧光检测器最终分离得到24个不同的

谱峰(GP1～24)，每个峰代表1种糖基化结构；其中

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GP8包括GP8a和GP8b，GP16包括GP16a和GP16b，

见图1。

2.2不同保存时间血浆样本中IgGN-糖基水平比较

对不同保存时间的5组血浆样本中IgGN-糖基的

24个糖基峰(GP1～24)中糖基结构进行比较，其结果

均无统计学意义，见表1-1和1-2。

2.3不同保存时间血浆样本中IgGN-糖基衍生指标含量比较

不同存放时间的5组血浆样品中13种IgGN-糖基

图1超高效液相分离出的IgGN-糖基结构的24个谱峰图

表1-1不同保存时间的5组样本中IgGN-糖基化水平比较(

-

x

±

s

)

IgGN-糖基2012年组2013年组2017年组2018年组2019年组

F

值

P

值

GP20.34±0.110.39±0.160.31±0.220.35±0.150.31±0.195.9670.202

GP420.76±2.7622.53±3.2722.64±4.5921.77±3.9320.21±3.881.8970.121

GP50.24±0.080.25±0.070.24±0.070.24±0.110.24±0.101.0770.898

GP64.44±1.114.95±1.194.45±1.034.46±1.065.13±1.511.1550.338

GP74.49±0.164.42±0.214.41±0.174.43±0.224.40±0.183.3040.508

GP818.63±1.8318.04±2.1117.33±2.9218.26±2.1617.32±3.012.4680.053

GP110.48±0.160.44±0.250.42±0.300.43±0.210.41±0.150.2690.897

GP120.81±0.310.79±0.300.75±0.310.80±0.370.74±0.250.1360.969

GP1418.92±3.3118.25±3.1219.78±3.2519.81±3.3117.77±5.160.9050.466

GP151.66±0.351.61±0.321.87±0.281.66±0.311.63±0.121.9540.111

GP162.80±0.312.87±0.462.81±0.452.74±0.512.83±0.620.1340.969

GP1811.42±2.4711.27±3.3412.58±1.8211.34±3.2711.74±4.100.4560.768

GP191.49±0.271.43±0.371.42±0.391.45±0.431.40±0.480.1050.980

GP210.33±0.060.30±0.120.31±0.100.25±0.150.29±0.091.0910.368

GP220.10±0.030.11±0.070.12±0.120.12±0.060.11±0.080.2670.898

GP230.99±0.420.95±0.490.92±0.370.97±0.370.99±0.750.0590.994

GP241.04±0.270.88±0.420.92±0.510.98±0.490.98±0.620.240.915

注：表中GP为所有糖基峰下面积总和

表1-2不同保存时间的5组样本中IgGN-糖基化水平比较[M(IQR)]

IgGN-糖基2012年组2013年组2017年组2018年组2019年组

H

值

P

值

GP10.07(0.08)0.08(0.09)0.08(0.07)0.08(0.06)0.05(0.08)1.4820.83

GP30.37(0.26)0.31(0.12)0.35(0.26)0.34(0.21)0.27(0.30)1.7480.782

GP98.95(1.20)8.43(2.53)7.51(4.25)7.59(3.64)7.68(3.61)4.2590.372

GP104.69(0.78)4.34(1.45)3.44(4.12)4.28(1.17)3.64(2.16)2.8410.585

GP130.47(0.08)0.50(0.22)0.39(0.32)0.44(0.18)0.35(0.32)3.7150.446

GP170.84(0.29)0.76(0.23)0.88(0.67)0.75(0.26)0.78(0.77)1.8070.771

GP200.03(0.010.04(0.08)0.03(0.070.06(0.030.03(0.073.9970.406

注：表中GP为所有糖基峰下面积总和

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对人血浆免疫球蛋白GN-糖基化水平的影响*-张杰等

-

±

s

)表2不同保存时间血浆样本中IgGN-糖基衍生物含量比较(

x

IgGN-糖基衍生物

Fuc

Bis

Gal

Gal-1

Gal-2

Sia

Sia1

Sia2

nFuc

nBis

nGal

nGal-1

nGal-2

2012年组

94.36±5.18

14.51±1.52

73.38±4.10

35.97±1.95

37.41±3.79

18.35±2.61

16.61±2.61

1.74±0.43

97.04±0.57

14.68±2.11

68.89±3.14

40.58±2.93

27.31±3.18

2013年组

95.88±5.46

14.78±2.02

71.49±4.38

35.09±3.39

36.39±3.88

18.13±3.69

16.42±3.50

1.71±0.62

97.16±0.51

14.81±2.25

65.42±4.63

39.49±3.43

25.93±3.67

2017年组

96.93±7.21

14.13±2.43

72.859±5.11

33.47±3.27

39.38±4.16

19.38±1.96

17.71±1.77

1.67±0.42

97.39±0.56

14.14±2.67

65.94±4.19

37.79±3.24

28.15±3.96

2018年组

95.39±4.38

13.91±1.46

72.11±4.88

34.15±3.69

37.97±5.86

17.97±3.72

16.35±3.53

1.64±0.45

97.21±0.59

13.89±1.71

66.87±4.42

38.66±2.83

28.21±5.14

2019年组

91.41±5.6

14.96±2.31

68.97±7.78

33.22±3.59

36.76±7.39

18.53±4.28

16.82±3.91

1.71±0.77

97.28±0.52

16.11±3.19

65.93±5.59

38.43±3.86

27.49±5.91

F

值

2.554

0.432

1.935

3.004

0.917

0.385

0.452

0.067

0.784

1.007

1.490

2.864

0.648

P

值

0.052

0.785

0.114

0.054

0.459

0.811

0.771

0.992

0.539

0.410

0.215

0.051

0.631

注：表中Fuc为总核心岩藻糖结构；Bis为总平分型N-乙酰葡糖胺结构；Gal为总半糖结构；Gal-1为单半糖结

构；Gal-2为总双半糖结构；Sal为唾液酸化；Sal-1为单唾液酸化结构；Sal-2为双唾液酸化结构；nFuc为未唾液酸化

的核心岩藻糖结构；nBis为未唾液酸化的平分型N-乙酰葡糖胺；nGal为未唾液酸化的半糖结构；nGal-1为未唾液酸

化的单半糖结构；nGal-2为未唾液酸化的总双半糖结构

衍生指标含量比较，差异均无统计学意义，见表2。

3讨论

N-糖基化(glycosylation)是蛋白质翻译后最普

遍的修饰形式之一，对蛋白质生物学功能发挥着至

关重要的作用[14-15]

样本，存储时间长短对血浆中IgGN-糖基化水平未

产生明显的影响，大规模的流行病学调查中超低温储

存的样本可以为后续的研究提供保障。

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化在IgG的结构和功能中扮演着重要角，IgG其

Fc段上高度保守的N-糖基结构的微小变化可以影响

Fc段的构型，进而改变甚至逆转IgG的分子功能。

N-糖基末端唾液酸和半糖修饰水平，可以调节

IgG与Fc受体结合能力，进而调控炎症通路，引发机

体抗炎与促炎状态改变；如果IgGN-糖基缺少核心

岩藻糖修饰，可以使抗体依赖的细胞介导的毒作用

增强，从而导致自身免疫性疾病发生[17]。因此，在大

规模的流行病学调查中检测不同人的血浆样本中

IgGN-糖基化水平对疾病的预防、发生和发展有着

重要的意义。

采用超高压液相谱串联质谱的方法，对超低温

条件下(-80℃)不同保存时间的血浆样本进行IgGN-

糖基化水平高通量检测，通过得到的特定谱峰型

对IgGN-糖基化水平进行分析。由于血浆样本中的

IgGN-糖基化水平因年龄、性别的不同而有所差异[18]。

4结论

在超低温(-80℃)条件下存放的血浆样本中IgG

N-糖基化结构及其总衍生指标的含量均未随着存储

时间的增长发生明显变化。超低温条件下储存的血浆

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收稿日期：2021-03-27

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