四君子汤对脾虚大鼠空肠黏膜损伤的修复作用及机制
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Chinese Journal of Veterinary Medicine 中国兽医杂志2012年(第48卷)第5期 57
四君子汤对脾虚大鼠空肠黏膜损伤的修复作用及机制
刘发强 ,何玉英 ,李杰峰 ,张挪威 ,昝军兰。,刘凤华。,许剑琴
(1.中国农业大学动物医学院中兽医实验室,北京海淀100193;2北京农学院动物科技系,北京昌平102206)
摘要:通过检测脾虚大鼠空肠中PCNA和IGF-1的表达,探讨四君子汤对脾虚大鼠空肠黏膜修复的影响。试验分对照
组、脾虚组、四君子颗粒治疗组和治疗对照组,每组采取空肠中段作样本;H.E.染法观察空肠组织结构,免疫组织化学法检
测PCNA和IGF-1的表达。脾虚组大鼠空肠绒毛长度、隐窝深度极显著降低(P<O.01);四君子颗粒治疗组大鼠绒毛长度、隐
窝深度的显著高于治疗对照组(P<O.05)。脾虚组大鼠空肠中PCNA、IGF-1阳性细胞数极显著增加(P%0.01);四君子颗粒
治疗组PCNA、IGF-1阳性细胞个数显著高于治疗对照组(P<O.05)。结果表明,四君子汤可以促进脾虚模型大鼠空肠的修复
过程。
关键词:胰岛素样生长因子一1;PCNA;空肠;脾虚
中图分类号:¥853.91;¥865.1 2 文献标识码:A 文章编号:0529—6005(2012)05—0057—03
Repair effects and mechanisms of Sij unzi decoction Oil damage
of the Jej unal mucosa in spleen。deficiency rat
LIU Fa-qiang ,HE Yu-ying ,LI Jie-feng ,ZHANG Nuo-wei ,ZAI Jun-lan ,UU Feng-hua2,XU Jian-qin
(1.China Aagricultural University,Beijing 100193,China;
2.Department of Animal Science and Technology,Beijing College of Agriculture,Beijng,102206,China)
AbstraCt:The purpose of this study was to investigate the effect of Sijunzi decoction on repair of the
jejunum mucosa of spleen-deficiency rat by detecting the expression of PCNA and IGF一1.This study in-
eludes four groups:control group,spleen deficiency group,Sij unzi decoction treatment group and treat—
ment control group.Part of iejunum of each rat was excised as samples;the methods of observation on the
structure of jejunum and detection of PCNA and IGF一1 were HE staining and immunohistochemistry,re—
spectively.Villus length and crypt depth of j ej unum in spleen deficiency rats decreased significantly(P<
0.05);villus length and crypt depth of rats in Sij unzi decoction treatment group was significantly higher
than those of rats in control group.The number of both PCNA-positive cells and IGF_1一positive cells in j ̄unum of
spleen deficiency rats increased significantly(P<O.01);the number of both two types of positive cells in spleen
deficiency group was all significantly higher than that in control group(P<O.05).These results showed that Si—
junzi decoction could accelerate repair of the jejunum mucosa of spleen-deficiency rats.
Key words:insulin—like growth factor一1;PCNA;jejunum;spleen-deficiency
Corresponding author:XU Jian—qin:LIU Feng—hua
中(兽)医脾虚证多表现消化系统功能障碍,证 动一系列反应保证黏膜结构的完整性,其中一个重
见完谷不化,食后作泻,大便稀溏,消瘦等。近年来 要的反应是肠组织再生,这是由肠干细胞参与的非
研究表明,脾虚证患者和大鼠模型的胃肠道组织会 常复杂的过程。细胞增殖标记物一增殖细胞核抗原
出现病理变化,如胃黏膜变薄,小肠绒毛损伤、萎缩,
(Proliferating Cell Nuclear Antigen,简称PCNA)
细胞器非正常变化等Ⅲ。当肠黏膜损伤时,机体启
是DNA聚合酶的重要辅助因子,常作为评价细胞
增殖状态的重要指标[2]。肠道隐窝干细胞的分裂状
收稿日期:2011-08-26
基金项目:高等学校博士学科点专项科研基金(20100008110—
态作为评价指标。PCNA生长因子可以调节多种
024);国家自然科学基金项目(30771591)
细胞的增殖、移行和分化,在维持肠黏膜稳态及其结
作者简介:刘发强(1986一),男,硕士生,研究方向为中西兽医结 构完整性方面发挥着重要作用_3]。有研究表明,胰
合,E-mail:liufaqiangl11@163.eom;何玉英(1964一),女,实验师,硕 岛素样生长因子一1(insulin-like growth factor一1,
士,主要从事小动物的临床检验,E-mail:hyyy@sina.corn
注:何玉英和刘发强对本文有同等贡献
IGF一1)可以加速肠黏膜损伤后的修复过程_4]。
通讯作者:许剑琴,E-mail:jianqinxucau@126.eom;刘风华,
四君子颗粒由党参、白术、茯苓和甘草四味中药
E-mail:liufenghua12O9@126.eom 组成,是治疗脾虚证的经典方剂。目前已有研究表
58 中国兽医杂志2012年(第48卷)第5期 Chinese Journal of Veterinary Medicine
明,四君子汤对大鼠和小鼠小肠免疫功能、胃肠运动
水合。二甲苯5 min洗2次,二甲苯:无水乙醇
(1:1)5 min洗1次,无水乙醇5 min洗2次,95 、 等生理活动有重要调节作用-5 ],但在脾虚动物肠黏
膜损伤修复过程中作用研究甚少。空肠是食物消
化、吸收的主要部位,为此,本试验检测空肠中PC—
NA和IGF一1的表达,探讨经典方剂四君子汤对脾
虚大鼠空肠修复过程的影响,为中兽医脾虚证之实
9O 、8O 、7O 、50 的乙醇各5 min洗1次,
ddH 2 O 5 min洗1次,PBS 5 min洗3次。(2)抗原
修复。用柠檬酸钠缓冲液(pH值6.O)于微波炉中
质、四君子汤的药理作用机制和临床应用提供理论
煮沸(高火5 min,中低火3 min 3次)。修复后,组
织切片自然凉至室温。(3)封闭内源性过氧化物酶
基础。
1材料与方法
1.1药物及主要试剂、设备成年SD雄性大鼠24
只,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。利
血平注射液(1 mg/mL),购自广东邦民制药有限公
司。四君子颗粒(党参、白术、茯苓和炙甘草),购自
湖北武当生物制药有限公司。石蜡(Sigma公司,美
国);苏木精、伊红(Sigma公司,美国);乙醇、二甲苯
(dk京化工厂);兔抗大鼠PCNA多抗(北京博奥森
生物技术有限公司);兔抗大鼠IGF一1单抗(Santa
Cruz,美国);兔抗体免疫组化试剂盒(南京凯基生物
技术发展有限公司);BH 型生物显微镜(Olympus,
日本)。
1.2动物分组、处理和样本采集 试验大鼠24只
适应性饲养3 d后,随机分为对照组、脾虚组、四君
子颗粒治疗组和治疗对照组,每组6只。试验第1
~7天,脾虚组、四君子颗粒治疗组和治疗对照组大
鼠以0.5 mL/kg体重[7 剂量腹腔注射利血平,对照
组以相同剂量和方法注射生理盐水。试验第8天,
处死脾虚组和对照组所有大鼠,每只大鼠取空肠中
段5 cm,置于4 中性甲醛溶液固定,用于制作石蜡
切片。四君子颗粒治疗组于试验第8天开始每天灌
服浓度为0.5 g/mL的四君子颗粒,8 mL/kg・d(剂
量根据人和大鼠体重换算,系数为0.018[1。 ;四君子
颗粒用蒸馏水溶解),治疗对照组灌服相同剂量生理
盐水,连续5 d,于试验第13天处死两组大鼠,采样
及样本处理和保存方法同脾虚组。
1.3 空肠组织H_E.染 石蜡切片经二甲苯常
规脱蜡,二甲苯:无水酒精(1:1)、无水酒精95
~5O 下行梯度酒精中各5 min,苏木精染约1O
min,蒸馏水冲洗、0.5 盐酸分后,自来水冲洗蓝
化30 min,经蒸馏水冲洗、酒精脱水上行至95 后,
放入0.5 伊红酒精染液染30 S,再依次入95 9/6
酒精、无水酒精、二甲苯,最后用中性树胶封片。
光镜下观察比较各组大鼠肠黏膜形态结构的变
化,采用Image—Pro Plus 5.1图像分析系统,测量
空肠绒毛长度、隐窝深度,每个肠道组织切片选取5
视野进行统计,取其平均值。
1.4 PCNA和IGF-1免疫组织化学法染 常规
方法制作石蜡切片,切片厚度4 m。(1)常规脱蜡
3 H2 O2室温孵育20 min。PBS中5 min洗3次。
(4)1%山羊血清37℃封闭20 min。(5)一抗孵育。
组织切片于200倍稀释的抗体溶液中4℃孵育过
夜。PBS中5 min洗3次。(6)在抗兔生物素化二
抗中,37℃孵育30 min。PBS洗3次,每次5 min。
(7)在链亲和素标记HRP溶液中,37℃孵育30
min。PBS洗3次,每次5 min。(8)DAB显2~5
min,显微镜下掌控。ddH 0洗3次,每次5 min。
(9)苏木精复染10 min,1 盐酸酒精分化,脱水、透
明后,中性树胶封片。
每组中随机选取3只大鼠的切片,每个切片高
倍镜下随机选取5个视野,观察染情况。PCNA
染结果以空肠每个隐窝PCNA阳性细胞数表示;
IGF一1染结果以平均每个视野的IGF一1阳性细胞
数表示。
1.5统计学处理 用SPSS Statistics 17.0统计软
件,显著性分析采用t检验,结果以平均值±标准差
表示。
2 结果
2.1 临床观察脾虚组、四君子颗粒治疗组和治疗
对照组大鼠在试验第3天出现精神倦怠、蜷缩,饮
食、饮水量下降;试验第5天出现体重降低、门污
秽、大便稀溏、被毛凌乱等症状。停止注射利血平至
第13天取样前,四君子颗粒治疗组大鼠的精神状
态、体重、饮食、饮水恢复程度明显好于治疗对照组。
2.2大鼠空肠形态学观察 H.E.染后观察,脾
虚组大鼠空肠绒毛顶端表皮脱落,绒毛、隐窝萎缩。
四君子颗粒治疗组的绒毛高度、隐窝深度显著高于
治疗对照组(P<0.05);两组空肠绒毛顶端损伤现
象基本消失。见图1、2。
2.3 PCNA的免疫组化检测 中插彩版图3和表
1结果显示,PCNA在4组大鼠空肠中都有表达。
每个隐窝PCNA阳性细胞数脾虚组极显著少于对
照组(PG0.01);四君子颗粒治疗组显著多于治疗
对照组(PG0.05)。
2.4 IGF一1的免疫组化检测表1结果显示,大鼠
空肠中IGF一1阳性细胞数脾虚组极显著少于对照组
(PG0.01);四君子颗粒治疗组极显著多于治疗对
照组(PG0.01)。
60 中国兽医杂志2012年(第48卷)第5期 Chinese Journal of Veterinary Medicine
中药复方对慢性热应激蛋鸡肺脏钙含量
及热休克蛋白70表达量的影响
段凯文,宋晓琳,郭 浩,高志民,石达友,郭世宁
(华南农业大学兽医学院,广东广州510642)
摘要:选用体质健康,体重、产蛋率基本一致的6o周龄海蓝白蛋鸡250只,随机分为5组:中药复方I、Ⅱ、Ⅲ组、电解多维
组、高温对照组。本试验检测蛋鸡肺脏中钙含量,并采用ELISA法测定蛋鸡肺脏组织热休克蛋白70(HSPT0)表达量。结果
显示,复方中药能够提高肺脏钙离子(Ca )浓度和HSP70表达量。复方I组能明显提高Ca 浓度。各药物组的肺脏HSP70
含量均高于高温对照组,其中复方Ⅲ组最为明显,但是复方I组对HSP70的增加效果最显著。结果表明,HSP70与钙含量变
化呈一定的正相关,中药有可能通过提高钙离子浓度而实现对HSP7O的调控。
关键词:中药复方;热应激;钙;热休克蛋白70
中图分类号:¥853.74 文献标识码:A
,
文章编号:0529—6005(2012)05—0060—03
Effects of compound Chinese herbal medicine on the cOncentrati0n of Ca2+and
regulation of HSP70 in lungs tissues of hens under chronic heat stress
DUAN Kai—wen,SONG Xiao—lin,GUO Hao,GAO Zhi—min,SHI Da—you,GUo Shi—ning
(College of Veterinary Medicine,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)
Abstract:Two hundred 60一day—age health laying hens with similiar weight and laying rate were ran—
domly divided into five groups:control group,vitamin C group,compound Chinese herbal medicine I group,
compound Chinese herbal medicine lI group,compound Chinese herbal medicineⅢgroup.The concentration
of Ca。 was detected and the expression of heat shock protein 70(HSP70)in lung tissues of all groups was
detected by ELISA.A11 of the compounds of Chinese herba1 medicine could improve the concentration of
Ca0 and increases HSP70 expression under heat stress.The effect of compounds of Chinese herbal medi—
cine T on increasing in concentration of Ca抖was the best one.Compound Chinese herbal medicine are in—
volved in promoting HSP protein synthesis induced by heat shock,and the effect of Chinese herbal medi—
cineⅢwas the best one.However,compound Chinese herbal medicine I could significantly increase HSP7O
expression.This study indicated that the effect of compounds of Chinese herba1 medicine on the change of
concentration of Caz and overexpression of HSP70 were the same,which may be related with the regulationof
HSP70 expression.
Key words:compounds of C hinese herbal medicine;heat stress;Ca什;HSP7o
Corresponding author:GU0 Shi—ning
高温季节,蛋鸡易发生热应激,在中医理论中,
热应激被称为暑热证或中暑,是暑邪和湿热乘机体
上应先清热利湿,湿邪得化,则蕴热之因除,两邪得
以分解,病即可转机 。近年来中药的研发与使用
越来越受到人们的重视,应用中药防治畜禽热应激
作者简介:段凯文(1987一),女,硕士生,从事中草药抗热应激方
面研究,E—mail:491122198@qq.corn
通讯作者:郭世宁,E—mail:shining@scau.edu.cn
正气不足之机侵犯机体所致,属湿热证 。在治疗
收稿日期:2011-07—26
基金项目:“十一五”国家科技支撑计划项目(2008BAQB4B01—
6);广东省教育部产学研结合项目(2008B09050025G);广东省中国科
学院全面战略合作资助项目(2010B090301040)
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