卞圈哪冲・２０１１・２・科技　・　ｌ　・　

一例奶牛发生牛支原体肺炎的诊断　

胡长敏　，彭清洁１，３，陈颖钰１，２，巴晓亮１’２，自智迪　，郭爱珍　

（１．华中农业大学动物医学院，武汉４３００７０；２．华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉４３００７０；　

３．国家肉牛产业技术体系疾病控制功能研究室，武汉４３００７０）　

中图分类号：￥８５８．２３文献标识码：Ａ文章编号：１００４—４２６４（２０１　１）０２—０００１—０３　

摘要：牛支原体是严重影响养牛业发展的重要病原。２００８年我们报道牛支原体导致“肉牛传染性牛支原体肺　

炎”以来，主要在肉牛发现该病。本文从临床出现类似症状的运输后发病奶牛采集样本，经细菌培养和支原体　

培养、特异性ＰＣＲ扩增和１６Ｓ　ｒＲＮＡ测序等病原学检测证实为牛支原体感染。　

关键词：牛支原体；奶牛；感染；呼吸系统疾病　

牛支原体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｂｏｖｉｓ）是感染牛的一种　

公司。按照文献［４１配制支原体液体与固体培养基，但　

重要病原，除导致牛肺炎、腺炎外．还可导致关节炎、　培养基中未加１％醋酸铊溶液。　

角膜结膜炎、耳炎、生殖道炎症、流产与不孕等多种　１．３细菌的分离培养　

疾病【ｌ１。在过去的两年中，我们确诊了数十起肉牛的　

按文献嘲取小块组织样本切面涂抹ＴＳＡ平板，　

牛支原体肺炎圜，发病牛都在不久前经历过长途运输。　

划线接种，３７ｃ【＝恒温箱内培养。菌落线培养后。用革　

近期湖北某奶牛场新购人９ｌ头奶牛，部分出现发烧、　兰氏染和油镜观察进行形态学初步鉴定。　

流涕、咳嗽、伴腹泻、关节肿胀等症状，就诊时已死　１．４　细菌的１６Ｓ　ｒＲＮＡ鉴定　

亡１５头。经实验室确诊为牛支原体肺炎，现就该奶　无菌牙签挑取单个菌落，加入装有适量灭菌水　

牛场临床发病与病原学鉴定情况报告如下。　

的无菌离心管中，煮沸１０ｒａｉｎ，冰浴１ｍｉｎ，１２　０００ｒ／ｍｉｎ　

１材料与方法　离心３０ｓ，取上清作为ＤＮＡ模板，按照本实验室建　

１．１　样品　立的方法，用１６Ｓ　ｒＲＮＡ通用引物进行ＰＣＲ扩增【３Ｊ．　

湖北某地奶牛场无菌采集并送检的奶牛肺脏、　所得ＰＣＲ产物经回收后克隆至ｐＭＤ一１８Ｔ载体中．　

喉及气管样品３份。　

送上海生物工程技术服务有限公司测序。测序结果　

１．２培养基　

与ＧｅｎＢａｎｋ中的相应序列进行同源性比对．确定菌　

胰蛋白胨大豆琼脂（Ｔｒｙｐｔｏｓｅ　Ｓｏｙａ　Ａｇａｒ，ＴＳＡ）￣　株鉴定结果。　

胰蛋白胨大豆肉汤（Ｔｒｙｐｔｉｃ　Ｓｏｙ　Ｂｒｏｔｈ，ＴＳＢ）培养基　

１．５牛支原体分离培养　

购自ＢＤ公司。按照试剂说明配置ＴＳＡ固体培养基　

分别将小块肺组织样本、气管拭子、喉拭子涂　

及ＴＳＢ液体培养基。类胸膜肺炎（Ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ—　

于ＰＰＬＯ固体培养基表面，于含５％ＣＯ　的细胞培养　

ｌｉｋｅ　ｏｒｇａｎｉｓｍｓ，ＰＰＬＯ）肉汤粉、酵母粉、琼脂粉等购　箱中培养；同时将小块组织样本投入到ＰＰＬＯ液体培　

自ＢＤ公司，ＭＥＭ培养基购自Ｓｉｇｍａ公司．马血清购　

养基中。２～３ｄ后，用光学显微镜低倍观察菌落形态　

自Ｈｙｃｌｏｎｅ公司，精氨酸购自上海伯奥生物科技有限　

支原体在固体培养基上菌落具有“煎蛋样”典型特　

收稿日期：２０１０—０９一Ｏ７　

征，液体培养基由红变为黄，并且透亮。　

基金项目：现代农业（肉牛）产业技术体￣（ｎｙｃｙｔ）ｒ＿３８）建设专项资金资助。　

１．６牛支原体的ＰＣＲ鉴定　

作者简介：胡长敏（１９７７一），男，湖北宜昌人，讲师，博士，研究方向为　

奶牛疾病　

用本实验室鉴定的牛支原体ＰＣＲ方法进行鉴　

通讯作者：郭爱珍。　定，同时将ＰＣＲ产物克隆至ｐＭＤ一１８Ｔ载体中，进行　

・２・　

测序分析ｌ　３ｌ。　

１．７药敏试验　

利用药敏纸片法（购于杭州天河微生物试剂有　

限公司）检测敏感药物。取纯化菌落接种于ＴＳＢ液　

体培养基中，３７℃震荡培养过夜，制备固体营养琼脂　

平皿，在琼脂表面均匀涂布菌液，将环丙沙星、恩诺　

沙星、氧氟沙星、头孢拉定、庆大霉素、丁胺卡那霉素、　

四环素、红霉素、磺胺、杆菌肽药敏纸片贴在培养基　

表面，置于３７℃恒温培养箱中培养２４ｈ后观察结果。　

用游标卡尺量取抑菌圈直径，根据药敏纸片说明书　

判定抗生素的敏感度。支原体药敏试验的培养条件　

同支原体分离培养，其余步骤同细菌的药敏试验。　

２结果与分析　

２．１发病牛的临床症状　

畜主反映，９１头泌奶牛分５次从山东省威海　

市山县运到湖北红安县，运输距离１　１００公里。首次　

运牛时间是２０１０年４月５　Ｅｔ，以后陆续运牛。牛运　

回半月左右发病，至５月１３日共死亡奶牛ｌ５头，死　

亡率达１６％。第３车牛运输时遇下雨，途中淋雨十多　

个小时，牛到场后第４天开始发病，发病率与死亡　

率均较其他批次更高。　

发病初期体温升高至４１～４２ｃＣ，患牛精神沉郁，　

食欲急剧下降甚至废绝，反刍减少或停止，部分牛　

伴有阵发性咳嗽并流清亮鼻液。严重者呼吸困难、张　

口呼吸；大多数牛出现腹泻，少数牛粪便带血；另外　

部分牛出现跗关节、膝关节肿胀，跛行、不愿行走等　

症状；病程稍长的患牛表现消瘦。　

２．２病理变化　

病死牛剖检变化主要集中在肺部。患牛肺脏尖　

叶、心叶及部分膈叶的局部有红肉变区和大量坏　

死灶散在分布：在病灶集中部位进行横切和纵切，　

可见切面湿润，轻轻挤压见脓样液体流出（图１）；肺　

脏切块投入水中后即沉入水底；从肺细支气管内可　

挤出粘液或粘液样分泌物，肺门淋巴结肿胀、出血；　

气管及喉内有泡沫样分泌物，气管壁及喉壁出血、　

充血（图２）。　

２－３　细菌分离鉴定结果　

牛肺组织中培养获得一种边缘光滑、湿润、圆形　

透明的菌落。革兰氏染后，显微镜下观察为革兰　

氏阴性短杆状细菌．扩增该菌的１６Ｓ　ｒＲＮＡ．测序分　

中固蚂才・２０１１・２・科技　

图１　肺组织买变及坏死　图２气雷充血、出血。见大量泡沫　

析后确定为大肠杆菌。　

２．４支原体的分离结果　

对该样品肺组织、喉拭子、气管拭子等病料接　

种液体及固体支原体培养基，接种喉拭子的平板上　

出现典型的“煎蛋样”外观的菌落（图３）。取培养的　

支原体菌落进行特异性ＰＣＲ扩增，获得阳性条带，　

略小于２５０ｂｐ，与理论值２３８ｂｐ相符（图４）。进一步　

进行１６Ｓ　ｒＲＮＡ测序分析，确定为牛支原体。　

ｂＤ　Ｍ　１　２　

２０００　

１０００　

７５０　

５００　

２５０　

２３８　

１０Ｏ　

图３　Ｍ．ｂｏｖｉｓ的ＰＣＲ扩增结果　一　图４喉拭子牛支原体　

Ｉ：Ｍ．ｂｏｖｉｓ扩增产物：２：阴性对照：　“煎蛋样”外观　

Ｍ：ＤＬ　２０００　ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　

２．５药敏试验结果　

药敏试验结果显示，该牛场所感染的支原体较　

敏感的抗菌药为菌必冶、多黏菌素Ｂ及先锋Ｖ；卡那　

霉素、壮观霉素、青霉素、氨苄等表现为中度敏感；　

而常规抗生素对致病菌与支原体完全不敏感。　

３讨论与结论　

３．１　牛支原体是感染牛的一种非常重要但又容易　

被忽视的病原，可以导致犊牛生长缓慢，成年牛　

泌量降低或引起多个器官的炎症问。牛支原体大　

都与巴氏杆菌、金黄葡萄球菌、化脓链球菌等感　

染相伴发：另外，牛支原体可与呼吸道合胞体病毒、　

传染性鼻气管炎病毒或牛病毒性腹泻病毒伴发。在英　

国所调查中的５５个牛场中，有半数牛场检测到牛支　

原体特异性抗体，但是仅７个牛场检测到呼吸道合胞　

体病毒、鼻气管炎病毒或牛病毒性腹泻病毒抗体　。　

瑞士牛支原体导致的呼吸道疾病占牛全部呼吸道　

卞圈码斗・２０１１・２・科技　

疾病的５０％Ｉ６１。在所有牛呼吸系统病原的混合感染　

中．牛支原体的感染居于首位　，９１。　

・３・　

支原体病．保障我国养牛业的健康快速发展。　

参考文献　

３．２在牛支原体病治疗药物的选择上，由于不同牛　

场病牛患病情况、病程、混合感染或继发感染情况　

［１】Ｎｉｃｈｏｌａｓ　Ｒ　Ａ，Ａｙｌｉｎｇ　Ｒ　Ｄ　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｂｏｖｉｓ：ｄｉｓｅａｓｅ，ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ（ｏｎｔｒｏｌ　

［Ｊ１．Ｒｅｓ　Ｖｅｔ　Ｓｅｉ，２００３，７４（２）：１０５一ｌ１２．　

【２］石磊，龚瑞，尹争艳，等．肉牛传染性牛支原体肺炎流行的初步诊断ｌＪ＿．华　

中农业大学学报，２００８，２７（４）：５７２　各异，很难确定一个统一的治疗方案。石磊等通过　

药敏试验证实环丙沙星等药物对部分支原体菌株　

敏感１３１，另有报道认为早期使用泰乐菌素类药物或　

土霉素也有一定效果　”。坚持早诊断、早治疗，把握　

动物临床用药原则、严格用药量及用药疗程、不滥　

［３】石磊，龚瑞，尹争艳，等．肉牛传染性牛支原体肺炎流行的诊断【Ｊｌｌ华ｃ　农　

业大学学报，２００８，２７（５１：６２９—６３３．　

ｆ４１中华人民共和国兽用生物制品质量标准委员会．中华人民共和国国家标　

准——牛传染性胸膜肺炎（牛肺疫）诊断技术ＧＢ／ＴＩ８６４９２２００２［Ｓ］．北京：　

中国标准出版社，２００２．　

【５］中华人民共和围卫生部医政司全国临床检验操作规程ｌＭ］．南京：东南　

大学出版社，２００６．　用抗生素，可以在一定程度上控制牛支原体肺炎。现　

阶段尚无有效的牛支原体疫苗，研究证实，牛支原　

体病通常在牛饥饿、寒冷、长途运输等应激状态下　

更易发生　，避免牛的长途运输、切实改善饲养环境　

和营养条件，提高牛的抗病力，是预防牛患支原　

【６　Ｐｏｕｍａｒ６Ｊａｔ　Ｆ，Ｌｅ　Ｇｒａｎｄ　Ｄ，Ｐｈｉｌｉｐｐｅ　Ｓ．ｅｔ　ａ１．Ｅｆｆｉｃａｃｙ　ｏｆ　ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ　ａｇａｉｎｓｔ　

Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｂｏｖｉｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ　ｉｎ　ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｌｙ　ｒｅａｒｅｄ　ｃａｌｖｅｓ【Ｊｊ　．

Ｖｅｔ　Ｍｉｃｒｏｂｉｌ，２ｏ０１，８０（１ａ）：２３—３５．　

［７】　Ｂｕｃｈｖａｒｏｖａ　Ｙ，Ｖｅｓｓｅｌｉｎｏｖａ　Ａ．Ｏｎ　ｔｈｅ　ａｅｔｉｏｐａｔｂｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｐｌａｓ／／ｌａ　

ｐｎｅｕｍｏｎｉａ　ｉｎ　ｃａｌｖｅｓ［Ｊ］．Ａｒｃｈ　Ｅｘｐ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｍｅｄ，１９８９，４３（５）：６８５—６８９．　

［８】　Ｎｉｃｈｏｌａｓ　Ｒ　Ａ　Ｊ１　Ｗｏｏｄ　Ｅ，Ｂａｋｅｒ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　

ｒｕｍｉｎａｎｔｓ　ｉｎ　Ｂｒｉｔａｉｎ　１９９５－２０００．Ｐｏｖｅｄａ　Ｊ　Ｂ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ　Ａ．Ｆｒｅｙ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ　＿

Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ　ｏｆ　ｒｕｍｉｎａｎｔｓ：ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　

体病的关键所在。　

牛支原体病是严重危害养牛业的传染性疾病，　

ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ［Ｃ］．Ｂｒｕｓｓｅｌｓ：Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ．２００１：１　１６－１２０．　

【９］冉智光，谢建华，骆璐，等．我国部分地区牛支原体肺炎和关节炎的病原体　

诊断ｆＪ１．中国预防兽医学报．２０１０，３２（１）：４０—４３．　

【１０】康云．肉牛支原体肺炎的诊断　Ｐ￣ＮＩＪＩ．畜牧　兽医．２０１０，２９（１）：１３０．　

本文是我国牛支原体导致奶牛支原体肺炎的首次　

报道。现阶段国内外缺乏有效的防治牛支原体的方法，　

亟需加强牛支原体免疫原性、致病机制等方面的研　

究，积极开发有效的诊断试剂及疫苗，有效防控牛　

［１１】Ｃａｓｗｅｌｌ　Ｊ　Ｌ，Ａｒｃｈａｍｂａｕｌｔ　Ｍ．Ｍｙｅｏｐｌａｓｍａ　ｂｏｒｉｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ　ｉｎ　ｃａｔｔｌｅ…　

Ａｎｉａ　ｔＨｅａｌｔｈ　Ｒｅｓ　Ｒｅｖ．２００８，８（２）：１６ｌ—ｌ　８６　

Ａ　Ｃａｓｅ　Ｒｅｐｏｒｔ　ｆｏｒ　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　Ｂｏｖｉｓ　Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ　ｉｎ　Ｄａｉｒｙ　Ｃｏｗｓ　

ＨＵ　Ｃｈａｎｇ－ｍｉｎ”，ＰＥＮＧ　Ｑｉｎｇ－ｊｉｅ　，ＣＨＥＮ　Ｙｉｎｇ—ｙｕ　。。，ＢＡ　Ｘｉａｏ—ｌｉａｎｇ’。，ＢＡＩ　Ｚｈｉ—ｄｉ　，ＧＵＯ　Ａｉ—ｚｈｅｎ　。　

（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｕａｚｈｏｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ　４３００７０；２．Ｔｈｅ　Ｓｔａｔｅｄ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ　４３００７０；３．Ｎａｔｉｏｎａｌ　ｂｅｅｆ　Ｃａｔｔｌｅ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｓｙｓｔｅｍ，Ｗｕｈａｎ　４３００７０）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｂｏｒｉｓ　ｉｓ　ａｎ　ｉｍｐｏ￣ａｎｔ　ｐａｔｈｏｇｅｎ　ｃａｕｓｉｎｇ　ｇｒｅａｔ　ｌｏｓｓ　ｉｎ　ｃａｔｔｌｅ　ｉｎｄｕｓｔｒｙ．Ｓｉｎｃｅ　２００８　ｗｈｅｎ　Ｍ．ｂｏｖｉｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ　ｉｎ　

ｂｅｅｆ　ｗａｓ　ｆｉｒｓｔｌｙ　ｒｅｐｏｆｌｅｄ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ，ｔｈｉｓ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｗａｓ　ｍａｉｎｌｙ　ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ　ｉｎ　ｂｅｅｆ　ｃａｔｔｌｅ．Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ，ｔｈｅ　ｄａｉｙ　ｃａｔｒｔｌｅ　ａｆｔｅｒ　ｒｅｃｅｎｔ　

ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｉｌｌ　ａｎｄ　ｈａｄ　ｓｉｍｉｌａｒ　ｓｙｍｐｔｏｍ　ｔｏ　ｂｏｖｉｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ．Ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎ　ｉｄｅｎｔｉｉｃａｔｉｆｏｎ　ｗａｓ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｂｙ　ｃｕｌｔｕｒｅ．ＰＣＲ　

ｂｏｒｉｓ．　ａｎｄ　１　６Ｓ　ｒＲＮＡ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｗａｓ　ｃａｕｓｅｄ　ｂｙ　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｂｏｖｉｓ；Ｄａｉｙ　ｃａｔｒｔｌｅ；Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｄｉｓｅａｓｅｓ