白细胞、血小板显微镜计数法
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白细胞显微镜计数法
(一)原理
取稀释酸溶液,将血液稀释一定倍数并破坏红细胞,滴入计数池,计数一定范
围内白细胞数,然后换算成每升血中白细胞数。
(二)试剂
白细胞稀释液:冰乙酸1.0ml,加蒸馏水至100ml,再加10g/l亚甲蓝(或结晶
紫)1滴,可使白细胞略着,用时便于区别红细胞稀释液。
(三)器材
1.显微镜:普通生物显微镜。
2.微量吸管:吸管上刻有10和20ul两个刻度(误差<+-1%)。微量吸管由于生产厂家
不同,质量也不相同,但不论哪家产品,在使用前均需经严格校正,且应做到每位
患者1支。
3.细胞计数板:计数板是用优质厚玻璃制成,每块计数板又分两个计数池。在计数池
两侧各有一条支柱,与计数池高度差是0.1mm。所以将一块平整的血细胞计数盖片
放在两条支柱上时,盖片底面与计数池之距离为0.1mm。
目前国内通用的是改良Neubauer计数板。这类计数板中,每个计数池的边线
长宽各为3mm,并被精密地刻划成9个大方格,每个大方格长宽各为1.0mm,其
面积为1m㎡。加盖玻片后的容积为1m㎡×0.1mm.其中四角上的大方格用单线划
成16个中方格,作白细胞计数用;中央1大方格则用双线划成25个小中方格,每
个小中方格又用单线划成16个小格,总计为400个小格。大方格每边长的误差是
+-1%;盖片与计数池面之距离误差为+-2%。
4.白细胞盖片:这是特制的血细胞计数用盖片,要求表面光滑平整,两面平整度为
0.002mm以内,有一定重量,不被血细胞悬液浮起。其厚度应为0.4—0.7mm,通
常大小为24×20×0.6mm。
盖片是否平整,可用光波干涉现象进行鉴定。其方法是:将盖片擦净后,平整放在
标准平面平晶上,用日光灯照射,观察在平面平晶上所见到的干涉条纹,判断其是
否合格。盖片在使用前应当用干净、柔软的吸水纤维制品拭净,特别注意勿让手接
触使其污染,否则充液时易产生气泡。
(四)操作
1.取小试管(12×75mm)一支,加白细胞稀释液0.38ml。
2.采指血20ul,吸入稀释液中,混匀。
3.用小滴管或点眼棒取少量混悬液,滴入计数池中,静止2—3min.
4.用低倍镜计数四角大方格的白细胞。计数时应按一定顺序,对压线的白细胞应按数
上不数下,数左不数右的原则计数。
(五)计算
白细胞/L=四大方格白细胞数(N)/4×10×106×20
=N×5/100×109
=N/20×109/L
式中:1/4标示平均一大方格中白细胞数。
×10表示10大方格内白细胞数。
×106表示1升稀释液中白细胞数。
×20为稀释倍数。
血小板显微镜计数
(一)原理
利用能保护血小板的稀释液,将血液稀释一定倍数,滴入计数池,计数一定范围
内血小板数,即可换算成每升血中血小板数。
(二)稀释液
1.草酸铵稀释液
草酸铵1.0g
EDTA-Na20.012g
蒸馏水加至100.0ml
配好后用数层滤纸过滤,清亮后使用。此液对红细胞破坏力较强,血小板形态清楚。
但只加草酸铵,不加EDTA盐,则易产生草酸钙结晶。
2.许汝和式稀释液
尿素(AR或GR)10.0g
柠檬酸钠0.5g
甲醛溶液0.1ml
蒸馏水加至100.0ml
混合后过滤即可备用。
此稀释液破坏红细胞完全,视野清晰,血小板清楚。但尿素易分解,可因室温升高
和保存过久而失效。一般只能使用10d,4摄氏度冰箱中保存,可稍延长使用期。
一次配量不宜过多。
归纳血小板稀释液的成分包括抗凝剂,如柠檬酸盐、EDTA盐等;固定防腐剂,如
甲醛等;溶血剂,如尿素、草酸铵等,以及等渗剂等。
一种好的稀释液应具备:(1)能有效地防止血液凝固;(2)迅速固定血小板,防止
其聚集和形态改变;(3)要求红细胞破坏完全;(4)组成简单,易保存,不生长细菌。
(三)操作
1.取稀释液0.38ml,采末梢血20ul加入稀释液中,混匀,静置10min左右。
2.混匀后取出少许滴入计数池,在温室中静置10—15min。
3.在显微镜下(低倍或高倍)计数中央大方格中5个小中方格(与红细胞同)的血小
板数。
(四)5小中方格血小板数(N)×5×10×20×106
=N×109/L
(五)注意事项
1.如血小板数过低,可计数25个中方格中的血小板数,结果×200.
2.凡影响红白细胞计数的技术因素都应注意。
3.全部器材和稀释液应十分清洁。因为血小板形态不规则且细小,任何灰尘斑点都可
给计数造成困难,甚至误认。
4.刺入皮肤深度要适当(2—3mm),血液应自然流出,避免挤压。动作要快,以防止
血小板聚集。
5.如和血常规一起做,应先采血小板计数用血。
6.因血小板易聚集,所以滴入计数池之前应充分混匀,但又不能用力过度,以防止破
坏血小板。
7.血小板在计数池中,完全下沉后方可计数。沉积时间短,结果偏低。但过长,计数
池中稀释液容易蒸发,尤其是夏季。所以最好将计数板放入温室中。
8.用尿素稀释液,一般应在1h内计数完毕,放置时间过长,计数结果偏低..
(六)质量控制
血小板计数质控较难,但应按操作规程,并认真参照注意事项,减少血小板聚集,破
坏,排除干扰,切实辨认血小板形态,减少误认。此外,还可根据经验进行质控,即在血片
上观察血小板与红细胞密度比例,估计血小板数量。根据陈缃介绍:梅10个油镜视野血小
板之和乘以2000,约为每微升血中血小板数。
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