药物开发馅饼相当大的切片是针对蛋白质的练习。找到一个有问题的蛋白质的活性位点或口袋，小分子中的东西干扰该蛋白质的功能，如果一切顺利，则治疗由该功能失常的大分子引起的疾病。

但只有大约15%的蛋白质具有这样一个方便的口袋或活性位点，导致其余的被认为是“不可遏制的”。一些研究人员和药物开发人员意识到该解决方案可能是针对RNA水平的疾病相关蛋白(参见“科学家们利用小分子药物瞄准导致疾病的RNAs”，“科学家”，2019年4月)。

信使RNA是一个明显的目标，因为它们编码蛋白质，甚至直接干扰某些疾病中的细胞过程。但其他RNA在一些药物开发商的视线中：非编码RNA，如调节基因表达的microRNA，也可能值得改变。毕竟，只有1%到2%的人类基因组被翻译成蛋白质，而大约四分之三被转录成RNA(PNAS，104：19428-33,2007)。

“由于具有靶向RNA的能力，你将极大地扩大潜在的药物靶标库，”马萨诸塞州剑桥市诺华生物医学研究所神经科学部罕见疾病负责人Rajeev Sivasankaran说。

正在开发的一种选择是使用反义寡核苷酸(ASO)，与靶RNA结合的短核酸序列并阻断它们或加速它们的降解。但这些大分子不易到达大脑和脊髓，它们会导致血小板计数下降，导致出血问题。

相比之下，小分子是经过验证的候选药物。RNA靶向药物是不寻常的，但并非不可能：例如，某些抗生素对细菌核糖体RNA起作用。结合RNA上的功能位点的小分子可以防止与核糖体或其他结合配偶体的相互作用。或者小分子可能促进RNA靶标的切割和破坏。科学家们正在应用高通量筛选和合理设计方法来鉴定将影响RNA生物学的分子。在这里，The Scientist调查了一些关键技术，使RNA成为药物开发中的下一个重点。

觉形状

了解RNA结构可以帮助科学家在药物可能结合的核酸上找到口袋。北卡罗来纳大学教堂山分校的化学家，以及开发RNA靶向药物的公司Ribometrix的联合创始人Kevin Weeks表示，一些RNA结构与蛋白质结构一样复杂。碱基配对导致二级结构，RNA形成发夹和螺旋。它们可以一起折叠成更复杂的三级结构，例如假结和多螺旋结。

Weeks设计了一种易于使用的技术，称为SHAPE(通过引物延伸分析“选择性2'-羟基酰化”的简称)来探测RNA结构(J Am Chem Soc，127：4223-31,2005;Nat Methods，11： 959-65,2014)。SHAPE识别RNA的哪些部分是松散的并且能够与试剂相互作用，并且哪些部分结合在阻止这种相互作用的结构中。

凭借靶向RNA的能力，您将大大扩展潜在的药物靶标库。

-Rajeev Sivasankaran，

诺华生物医学研究所

在这种情况下，试剂是一组化学物质中的一种，其可以潜在地附着于四种RNA核苷酸A，U，G和C中的任何一种，用所谓的2'-O-加合物标记每种。关键的诀窍是：“它只能在一些摇摆或构象灵活的核苷酸上与RNA反应，”Weeks说。例如，在RNA发夹中，沿着针长度的碱基配对核苷酸将受到保护，但是核苷酸游离的末端的环可以被试剂修饰。

结果是RNA分子，其中某些碱基用加合物标记，而其他碱基未标记。然后，Weeks和他的团队使用逆转录酶制作该RNA的DNA拷贝。当酶沿RNA传播时，它会与标记的碱基形成错误，从而产生错配的核苷酸。当科学家对DNA进行测序时，这些错误会显示为突变，并指向原始RNA未被结合的位置。

研究人员可以将他们的序列输入软件，可以在Weeks的网站上免费获得，预测结构。Weeks表示，它“非常可靠，但不是100%完美”。该技术适用于试管和内部细胞。

直接到屏幕

在最近的高通量筛选中，Novartis偶然发现了与RNA和剪接体结合的小分子，以减轻与脊髓性肌萎缩相关的剪接缺陷(Nat Chem Biol，11：511-17,2015)。然而，那些研究人员并没有专门寻找RNA结合物。密歇根大学安娜堡分校的化学生物学家Amanda Garner从一开始就设计了一个针对RNA的屏幕。具体来说，她是在结合微小RNA的小分子之后。

她的方法是ELISA(酶联免疫吸附测定)的变体，其使用抗体来检测肽或蛋白质。它被称为催化酶连接的点击化学测定，或cat-ELCCA(Chem Commun，52：8267-70,2016)。该测定法检测干扰发夹形pre-miRNA成熟为功能性microRNA的小分子。

第一步是将感兴趣的pre-miRNA与分子标记连接起来，使其在以后可检测到。在发夹顶部的环路上，Garner附着一个叫做TCO(反式环辛烯)的8碳环。她将这些标记的pre-miRNA固定在384孔板的底部。然后，她从化学库中添加了不同的化合物，使他们有机会结合miRNA。之后，她补充了Dicer，这种酶负责切割pre-miRNA以使它们活跃。

Dicer切割任何未被小分子束缚的发夹，切断TCO。然而，附着在小分子上的miRNA受到Dicer刀片的保护。最后，加纳添加了与四嗪结合的辣根过氧化物酶，四嗪可与TCO结合。仅存在于未切割的miRNA上的过氧化物酶的活性可以用化学发光测定法检测，并且用平板读数器鉴定发光孔。任何发光的井都是潜在的打击。

在最近的一项研究中，Garner使用cat-ELCCA筛选阻断pre-miRNA切割miR-21的化合物，miR-21是一种在大多数癌症中过表达的microRNA。在大约83,000个小分子和天然产物中，她报告了1,819次点击，其中217次在一式三份测试后得到确认。

一个小分子结合感兴趣的RNA是不够的;它还必须忽略细胞中的所有其他RNA。为了开始解决这种特异性，Garner及其同事检查了他们的miR-21结合物与对照pre-microRNA的相互作用，称为pre-let7-d。一些天然提取物对miR-21具有选择性，Garner与合作者一起确定了一种纯化合物，可能是最终抗癌药物的候选物。(SLAS Discov，23：47-54,2018)。

设计师药物

不是每个人都可以访问大型化学库。佛罗里达州朱庇特斯克里普斯研究所的化学生物学家马特迪斯尼指出，大多数小分子文库的设计都考虑了蛋白质靶标，他是Expansion Therapeutics的联合创始人，该公司是一家针对病理扩展的RNA重复序列的药物开发公司。也就是说，最适合靶向蛋白质的参数可能不适用于RNA。例如，RNA结合剂可能不需要相同的严格分子量标准 - 通常小于500道尔顿 - 用于蛋白质靶向药物。

迪士尼采用合理的设计方法来靶向RNA。他的实验室设计了一条管道来识别和利用RNA和小分子之间有希望的相互作用(J Am Chem Soc，doi：10.1021 / jacs.8b13419,2019)。

它从二维组合筛选或2DCS开始(J Am Chem Soc，130：11185-94,2008)。迪士尼的想法是将两个文库 - 一个不同的RNA结构 - 另一个小分子 - 通过将微小分子附加在微阵列中，并将它们暴露于数万个RNA基序的混合物中。RNA用荧光或放射性化合物标记，因此每次命中，定义为小分子和RNA基序之间的成功结合，在微阵列上产生可检测的斑点。研究人员切除这些命中并使用RNA测序来识别它们。

接下来是数据处理。迪士尼集团开发了一项名为HiT-StARTS的统计程序，通过测序实现高通量结构 - 活动关系。基本上，HiT-StARTS压缩数据以评估每个RNA基序 - 小分子对之间的相对亲和力(ACS Cent Sci，3：205-16,2017)。

研究人员随后将这些数据和RNA序列输入其数据库Inforna，该数据库可在迪士尼的网站上获取(Nat Chem Biol，10：291-97,2014)。该数据库目前包括约40,000个RNA-小分子相互作用，并定期更新。Inforna挖掘数据库以找出最佳的RNA-小分子相互作用。

Inforna指出了几种潜在的可药用RNA。研究人员也可以考虑到特定的RNA来到Inforna，并寻找可能的结合口袋和小分子。

例如，Scripps团队使用Inforna来识别潜在的强直性肌营养不良的先导化合物，这是一种以肌肉僵硬为特征的成人肌肉萎缩疾病。它是由基因DMPK中重复序列的失控扩增引起的，导致mRNA连续存在数百或数千个CUG。这种扩增的RNA粘附于剪接因子，干扰其他mRNA的加工。

扩展后的RNA自身翻倍，与C和G的基础配对形成一系列连接，U的伸出。迪士尼的团队使用Inforna来设计与这种异常链结合的小分子，而不是正常长度的DMPK转录本，它们不构成这种结构。然后，对于这些化合物中的一种，它们附着核酸裂解抗生素和抗肿瘤剂博来霉素。被称为Cugamycin的组合发现并切断异常RNA(Nat Chem Biol，13：188-93,2017)。当注射到肌强直性营养不良的小鼠模型中时，Cugamycin使大多数与疾病相关的RNA错误剪接事件正常化并降低肌肉强度。

体内验证

在试管中结合RNA的先导化合物在细胞中可能不会以相同的方式起作用，因此验证活体材料中的小分子作用以及检查脱靶RNA结合非常重要。迪士尼也有针对这些问题的入门工具箱。

一种选择是化学交联和通过下拉分离，或Chem-CLIP(Angew Chem Int Ed Engl，52：1001-13,2013)。研究人员将他们的RNA结合小分子与交联剂(如烷基化剂苯丁酸氮芥)和一种方便的下拉剂(如生物素)联系起来。交联剂将小分子附着到RNA靶序列上。然后，科学家们可以通过测序确定拉下结合的RNA并进行鉴定。

对于那些不喜欢Chem-CLIP要求的化学研究人员，迪士尼开发了一种不同的选择，称为反义寡核苷酸配体结合位点定位，或ASO-Bind-Map，以检查小分子与特定RNA的相互作用(Chem， 4：2384-404,2018)。它依赖于所讨论的小分子来粘附靶序列并阻断ASO结合。如果ASO不能结合，它将不会促进与其序列匹配的RNA的破坏。在ASO-Bind-Map中，研究人员用小分子和一系列ASO处理靶细胞的细胞。然后，他们可以扩增和测序该靶RNA，寻找受ASO介导的破坏保护的区域。

即使有这些最新进展，RNA药物工具箱还远远不够。迪士尼表示，制药行业需要更多这样的检测来验证目标。而Weeks希望提高SHAPE推断RNA的三级形状的能力。如果科学家们使用它们来识别RNAs的正确位置(具有可能药物的口袋)，那么像Weeks和迪士尼这样的设计工具可以与屏幕一起工作，可以在屏幕上用作诱饵。

像脊柱肌肉萎缩药物这样的项目 - 现在正在临床试验中 - 以及研究人员发现的其他先导化合物表明它是一个值得填充的工具箱。迪士尼说：“所有这些东西都说，是的，你可以用小分子吸毒。”“我们真的需要这样做。”