几乎人体中的每一个细胞，从心脏细胞到细菌吞噬免疫细胞，都是由被称为线粒体的专门细胞器产生的化学能量驱动的。能量产生过程会产生高毒性的废物，因此，与真正的发电厂一样，这些细胞器需要严格的质量控制和监督。

这种生死攸关的任务确保了细胞及其所属生物的存活。细胞能够去除受损线粒体的能力与从癌症到神经退行性疾病 - 特别是帕金森病 - 的病症有关，其中耗电的神经元非常容易受到有缺陷的线粒体的毒性作用的影响。

在4月19日出版的“分子细胞”杂志上，哈佛医学院的科学家们报告说，他们开发了一种新技术，以前所未有的定量精度分析细胞如何通过细胞自噬或“自食”系统开始去除有缺陷的线粒体。该方法允许他们首次研究源自干细胞的人类神经元中的这一过程。

通过将蛋白质景观的“数字快照”作为细胞标记受损的线粒体进行自噬，研究团队生成了迄今为止该过程动态的最清晰图像，包括蛋白质修饰反应的绝对测量及其丰度和随时间的变化。

作者说，这些结果为详细研究线粒体损伤，细胞死亡和疾病之间的联系奠定了基础，并建立了一种技术方法，可用于揭示许多其他环境中有缺陷的细胞通路的机制。

高级研究报告作者J. Wade Harper说：“如果有一种针对这种途径的药物以治疗帕金森病或其他神经退行性疾病为目标，我们将需要这种程度的细节来了解候选药物的工作原理。” ，HMS Bert和Natalie Vallee分子病理学教授和细胞生物学系主任。

用于线粒体质量控制的分子报警系统涉及两种酶：蛋白激酶PINK1，其用磷酸盐化学修饰蛋白质;和泛素连接酶PARKIN，其用称为泛素的分子标记靶蛋白。

在正常情况下，健康的线粒体在其外表面上携带很少的PINK1。然而，当受损时，线粒体会积累PINK1，将磷酸盐转移到PARKIN以激活它。

一旦激活，PARKIN将泛素转移到各种不同的蛋白质上，在线粒体表面形成“泛素外壳”。当达到一定的泛素阈值时，触发细胞“自食”机器的募集，导致线粒体的降解。

PINK1和PARKIN的突变已经通过大量研究与帕金森氏病相关联，帕金森氏病涉及某些神经元的死亡和大脑中不正确折叠的蛋白质的累积。研究人员在描述PINK1-PARKIN途径方面取得了很大进展，但其许多关键特征仍然知之甚少。

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已知遍在蛋白在氨基酸赖氨酸的特定残基上标记其靶蛋白。然而，这仅发生在一小部分赖氨酸残基上，并确切地确定了哪些赖氨酸被修饰以及为什么对该领域是一个挑战 - 特别是对于线粒体表面上的十几个PARKIN靶标。此外，这些目标的丰度尚不清楚，这可能会影响泛素化过程。

哈珀实验室以前与HMS细胞生物学教授Steve Gygi合作开展的工作已经建立了一些方法，可以检测与泛素相关的蛋白质中的单个赖氨酸残基。

研究小组在当前的研究中扩展了这种方法。由主要作者，细胞生物学HMS研究员Alban Ordureau带头，他们开发了一种新方法-PAPIN目标 - 平行反应监测(Pt-PRM) - 以前所未有的细节水平评估参与线粒体质量控制的蛋白质泛素化的前景。

他们还创建了一个参考肽库，使他们能够测量受损线粒体上PARKIN靶标的精确丰度和个体泛素化事件。

从本质上讲，参考肽库使研究人员能够在质谱仪中同时以十二种线粒体表面蛋白的位点特异性方式“计数”泛素化事件。

当与线粒体损伤后的时间依赖性测量相结合时，该方法产生线粒体表面泛素化事件的“数字快照”，不仅揭示了修饰的位点特异性，而且还提供了线粒体景观的定量图像。

通过包括检测PINK1依赖性磷酸化事件的参考肽，该团队还能够将靶磷酸化与泛素化相结合。

“这是迄今为止对泛素通路进行的最详细的分析之一。没有其他研究使用这种复杂程度来分析这样的过程，”哈珀说。

数码快照

新技术允许对蛋白质泛素化事件进行准确，绝对的测量，与之前的非定量方法形成鲜明对比，不提供泛素化 - 位点特异性。

“这种方法现在为我们提供了完整的动态范围，”哈珀说。“我们可以测量超过三个数量级，以更好地了解动力学，化学计量学，空间组织，与磷酸化的整合以及许多其他特征，”哈珀说。

通过提高精确度，该团队对来自遗传修饰的人类干细胞的神经元中的天然泛素化相关事件进行了首次定量分析，该系统与人类疾病研究相比，与以前的模型相关。

这包括对多巴胺能神经元的分析，其丧失是帕金森病的主要特征，与哈佛大学干细胞和再生生物学教授李鲁宾合作完成。到目前为止，该领域的大多数研究都是在永生化人类癌细胞(HeLa)上进行的，这些细胞被设计成以非常高的水平表达PARKIN，以便科学家们可以测量它们的活动。

Harper，Ordureau及其同事在他们的分析中比较了两种细胞模型，确定了修饰事件的特异性和时间的相似性和差异。他们还在蛋白质上发现了特异性赖氨酸残基，这些残基在神经元中被选择性地泛素化，但在HeLa细胞中没有，反之亦然。这组作者说，这些差异的生物学意义仍然未知，并且是进一步研究的目标。

这些分析有助于揭示该领域目前存在争议的问题，例如泛素链是否不加思索地标记线粒体上的蛋白质，或者它们是否精确定位特定的蛋白质。

答案可能是“取决于”。一般来说，泛素化似乎随着蛋白质的丰富而扩大，但研究人员也发现了选择性的证据，特别是在目标蛋白质中的某些结构元素内。

实验系统的稳健性还允许作者检查该途径的几个机制方面，包括例如确定PINK1在干细胞衍生的神经元中的PARKIN磷酸化的作用。

“我们想知道这些机制是如何起作用的，因为我们希望能够将它们作为药物发现的目标，或者找到绕过病人致病突变的方法，”Ordureau说。“我们现在可以非常详细地分析神经细胞中的这一关键过程，并在一次实验中大规模地进行分析。使用以前的方法，你必须进行数十次实验才能获得相似或不太准确的结果。”

他们的新方法的功效现在能够改进PINK1-PARKIN途径的研究及其在帕金森病等疾病中的作用，如PINK1小分子活化剂的研究所证明。作者说，该方法还可以用于揭示其他系统和疾病中缺陷通路的机制。

“泛素化是细胞用来去除受损或不需要的成分以保持自身健康和完整性的基本机制，”哈珀说。“它不仅与线粒体有关，而且与细菌，蛋白质聚集体和其他细胞器的去除有关。这项技术可用于揭示许多不同系统的生物化学。”